胞基因样品顺序:|3-3(^111、3(?2、0(^4、他11(^、0)133、0)45;VSELs 基因样品顺序:CD45、CD133、Nanog、Oct4、Sox2、0-actin。
[0015]透射电镜显示猪VSELs十分细小，5?7微米，细胞超微结构表现为细胞核大、细胞质少。免疫荧光染色证实其表达胚胎样干细胞标志Nanog、SSEA-1、Oct-4、Sox-2，非造血干细胞标志Lin(-)、CD45(-)、CD133(+)和其它干细胞标志CXCR4(+)，碱性磷酸酶染色阳性。
[0016]本发明方法涉及到的主要实验仪器，包括超净工作台、C02恒温培养箱、倒置荧光显微镜、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡仪、冰箱、电子天平制冰机、超纯水设备、免疫磁珠分选仪、流式细胞仪、5810R型低温高速离心机等。涉及到的主要实验器械，包括(1)手术器械:骨髓穿刺包，lmL、5mL、20mL注射器。(2)细胞培养相关实验器材:T 25细胞培养瓶、6孔、24孔及96孔细胞培养板，15mL及50mL离心管，0.22um滤膜及塑料滤器，40um滤网，烧杯，量筒，细胞计数板等。涉及到的主要实验试剂，包括DMEM/F12培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、双抗(青、链霉素)、RPMI 1640条件培养基、胶原蛋白酶Π、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIH等。
[0017]本发明的优越性在于:
1.采用成肌细胞饲养层培养极小胚胎样干细胞显著增加扩增成功率，而无饲养层细胞培养VSELs则培养失败；
2.方法实用、易行，可重复性强；
3.可靠性明显增加，细胞得率高；
4.取材方便、实用；
5.为偶蹄类动物其它组织如外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等VSELs的扩增和鉴定提供了新的方法，同时也为偶蹄类动物VSELs细胞后续研究提供了方法和途径；
6.该技术也适用于其它物种如鼠、人、禽类等VSELs的培养、鉴定，可用于珍贵物种的研究与开发。
[0018]发明提出的VSELs的高效培养方法和精准的鉴定步骤具有巨大的应用前景，为VSELs的临床研究提供了重要的技术保障。
【附图说明】
图1猪成肌细胞饲养层；
图2采用成肌细胞饲养层培养极小胚胎样干细胞；
图3无成肌细胞饲养层培养极小胚胎样干细胞；
图4无成肌细胞饲养层培养骨髓间充质干细胞；
图5透射电镜下观察比较猪骨髓极小胚胎样干细胞及MSCs的超微结构；
图6细胞间接免疫荧光检测；
图7 VSELs碱性磷酸酶染色呈深棕红色；
图8荧光定量RT-PCR从基因水平检测极小胚胎样干细胞和成肌细胞；
图9凝胶电泳图显示极小胚胎样干细胞胚胎样标记物表达水平显著高于成肌细胞。
【具体实施方式】
[0019]实施例一
一、猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法
1.分离同种乳猪成肌细胞
(1)将乳猪麻醉后，无菌条件下分离新生乳猪的骨骼肌样本，用PBS清洗，并尽量剔除表面结缔组织；
(2)将骨骼肌组织样本置于离心管中，剪成1mm3的块状，加入lg/L的胶原蛋白酶Π，置于37 °C恒温水浴中消化，20?40分钟后，1200 rpm离心6分钟，弃上清；
(3)加入0.25%胰蛋白酶消化液，轻微吹打3?5分钟，可见消化液变浑，此时取上清液于另一干净的试管中，加入等体积含有10?15%胎牛血清的DMEM终止消化，剩余组织可重复消化1次；
(4)轻轻吹打细胞悬液，尽量吹散细胞。用400目过滤筛过滤，1200rpm离心6分钟，弃去上清液。用新鲜DMEM液洗2?3次，1200 rpm离心6分钟；
(5)用10?15%胎牛血清+ 10%马血清的F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，至于培养箱中培养；
(6 )培养1.5?2小时后，将上清液移于另一培养皿中继续培养，以去除非肌原性细胞；
(7)培养5?6天，细胞生长至80%贴壁，可以进行传代；
(8)弃去培养基，用PBS清洗细胞3次，加入适量0.25%胰酶消化液，3?5分钟后用含有10 %胎牛血清的培养基终止消化，1200 rpm离心6分钟，用培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37 °C，5 % C02培养箱中继续培养;40分钟后，将上清液移于另一培养皿中继续培养。
[0020]2、乳猪成肌细胞饲养层制备
(1)将传至3代的细胞的培养基吸出，加入适量丝裂霉素C溶液，置于培养箱中培养1?2小时后，弃去丝裂霉素C溶液，用PBS清洗7?8次，加入适量0.25%胰酶消化3?5分钟，用含有10 %胎牛血清的培养基终止消化，1200 rpm离心6分钟，用培养基重悬清洗细胞2次，1200 rpm离心6分钟，培养基重悬细胞，接种于96孔板中，置于培养箱中培养；
(2)观察到细胞融合至60%左右，即获得成肌细胞饲养层。图1所示为乳猪成肌细胞饲养层。
[0021]3、极小胚胎样干细胞培养
(1)将流式分选后得到的VSELs分别接种于铺有成肌细胞饲养层和无饲养层细胞的培养板中，用RPMI 1640培养基进行培养，同时以骨髓间充质干细胞进行对照。培养于37°C、5%C02的培养箱中，并添加双抗和LIF、bFGF、SCF等细胞因子进行培养；
(2)观察细胞生长情况，每2天更换1次培养液，原代细胞培养至10天左右可以进行传代。培养于成肌细胞饲养层的VSELs至3天呈现聚集趋势，至5天形成类似细胞克隆的细胞集落，随着培养时间的增加，细胞集落增大，数量也有所增加。图2所示自左至右分别代表接种于成肌细胞层的极小胚胎样干细胞第3、5、10天增殖情况，3天开始聚集，5天形成细胞克隆，10天细胞集落进一步增大。而无成肌细胞饲养层只有RPMI 1640条件培养基培养则不能形成类似细胞克隆的细胞集落，至10天仍无明显增殖。图3所示为骨髓间充质干细胞在单纯RPMI 1640条件培养基培养3-4天后开始呈梭状生长;图4所示为骨髓间充质干细胞，原代细胞培养至10天左右可以进行传代。
[0022]二、透射电镜鉴定猪VSELs的方法
将分离或培养后的CD45 (-) CD133C + ) lin (_)的单核细胞以及骨髓间充质干细胞收集、固化、包埋进行透视电镜观察细胞形态和超微结构，透射电镜观察。图5中左图为极小胚胎样干细胞，细胞核大，胞质少，细胞器不发达，核质比高，直径约5-8um;右图为间充质干细胞细胞核较小，胞质丰富，细胞器发达，核质比相对较低，直径约8-llum。
[0023]实施例二
一、猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法步骤同上，不再重复表述。
[0024]二、细胞间接免疫荧光鉴定猪VSELs的方法
(1)将分离或培养后的VSELs培养液从培养孔板中吸出，加入4 %多聚甲醛固定细胞30min，PBS润洗3次;0.2% Triton X -100透膜处理20min，PBS润洗3次；含 10% FBS的PBS封闭2 h；
(2 )分别在不同孔中加一抗Sox-2、Oct-4、Nanog，4°C冰箱过夜；
(3)过夜细胞孵育后，分别加入相对应的二抗;添加0.5%Tween 20的溶液(PBS-T)润洗3次，每次5min，滴加二抗，37°C温育2 h(避光)；PBS-T润洗3次，每次5min ；
(4 )5ng/yL DAPI常温下染色2 min；
(5)荧光显微镜观察。图6中免疫荧光鉴定猪骨髓极小胚胎样干细胞高表达SSEA-1、Nanog、 Oct-4和Sox-2;
(6)碱性磷酸酶(AKP)染色将荧光染色后的细胞孔板中的培养液吸出，加入配置好的碱性磷酸酶染色液，放在倒置显微镜下观察。图7中极小胚胎样干细胞经碱性磷酸酶染色呈深掠红色。
[0025]实施例三
一、猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法步骤同上，不再重复表述。
[0026]二、基因水平鉴定猪VSELs的方法一.RNA提取
(1)将细胞悬液收集至离心管中，lOOOrpm，6-8min之后用roS重悬细胞，重复三遍以达到清洗细胞的目的，按1 X 107细胞加入lmL TRIZ0L试剂；
(2)将上述样品于15-30°C(常规室温即可)静置5min，使蛋白质充分解离；
(3)加入0.2mL氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30°C静置2-3min;
(4)于2-8°C12000rpm离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA;
(5)取上清，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，于15-30°C静置lOmin后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA;
(6)于4°C12000rpm离心lOmin后，弃上清;
(7)向沉淀中加入lmL75%乙醇，轻轻混匀；
(8)于4°C7500rpm离心5min后，弃上清；
(9)将RNA样品晾干，加入适量去离子甲酰胺溶解(可于55-60°C促溶lOmin)。
[0027]二.反转录制备CDNA
(1)制备gDNA去除反应体系将5 XgDNA Buffer 2μ 1、Total RNA -、RNase-FreeddH20补足至10μ1混合均匀，简短离心，于42°C孵育3min，至于冰上备用；
(2 )反转录反应体系:将 10 XFast RT Buffer 2ul、RT Enzyme Mix luKFQ-RTPrimer Mix 2ul、RNase_FreeddH20 补足到lOul;
(3)将反转录反应体系中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀；
(4)42°C孵育15min，95°C孵育3min，得到的cDNA用于后续实验，或-20°C保存。
[0028]三荧光定量RT-PCR
(1)建立20μ?反应体