具有增加微量元素含量的转基因植物及其生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有增加微量元素含量的转基因植物及其生产方法。
【背景技术】
[0002] 微量元素营养，如铁(Fe)、锌(Zn)和锰(Μη)的缺乏，是一个普遍问题。已经有若干 策略被用来解决这个问题，其中之一是遗传修饰植物，其中所述微量营养元素增加。以这样 的方式，摄食这些植物的受试者中的微量元素可得以改善。
[0003] 尽管铁(Fe)是地球上最丰富的元素之一，铁缺乏症是最普遍的人类群体的营养障 碍。膳食铁的摄入量不足(特别是在铁供应主要或完全依赖于植物的地区）所造成的缺铁性 贫血（IDA)影响全球超过十亿人。通过施加铁肥料增加在土壤中生物可利用铁的水平是昂 贵的且不可持续的，并且不能针对所需植物部分。因此，提高铁的获取以及将其运输至可食 用植物部分是战胜IDA所必须的。
[0004] 植物演化了多方面的策略以从土壤中获取铁（1)。禾本科物种（Graminaceous species)在从麦根酸(mugineic acid)家族分泌通过T0M1以高亲和性结合铁的植物铁载体 (phytosiderophores(PS))之后摄取铁，随后通过YSL转运子摄取(三价铁)Fe-PS复合物。拟 南芥(Arabidopsis)和所有非草作物物种采用基于还原铁的获取策略，其中铁首先由氧化 还原酶AtFR02进行还原。亚铁随后由AtIRTI跨质膜输送（1，2)。这两个铁获取策略过去被认 为是相互排斥的(4)。但是，水稻(Oryza sativa)具有一个Fe2+的摄取系统(5)以及拟南芥分 泌铁结合香豆素类似草类的PS-系统（6-8)，这表明这两个铁获取策略可以包括共同的组 份。
[0005] 在拟南芥中，bHLH型转录因子AtPYE和AtFIT控制参与铁获取和细胞内稳定的基因 的非重叠亚组OhAtFIT作为异源二聚体与lb亚组的bHLH转录因子AtbHLH038，AtbHLH039、 八七1^1^100和厶七诎1^101发挥作用（10，11)。在水稻（0巧23 83^￥3)0811?02中4让乩!1100/ 101的直系同源物调节所述的Fe-PS转运子0sYSL15,但不经由OsIRTl吸收Fe2+(12)。编码 AtbHLH038/39/100/101和0sIR02的基因是铁响应的，提示为上游调控组件。与动物中相似， 在植物中感知铁通过铁与调节蛋白的直接结合发生，在水稻中为OsIDEFl/OsHRZs以及拟南 芥中为在 AtBTS(13，14)。
[0006] 有必要来产生具有增加微量元素含量的转基因植物，由此可以解决微量元素缺乏 的问题。
【发明内容】
[0007] 我们在此报告了一个新的肽家族，其在整个被子植物中许多高度多样化的肽种共 享保守的短C末端氨基酸序列基序。我们叫这种肽序列IRON MAN(MA)，指的是其通过激活 铁摄取的基因而启动铁和锰积累的能力。令人惊奇的发现，IMA对于在植物中的铁缺乏信号 传递是至关重要的，其作用在控制摄取、转运和铁的细胞稳态级联的早期，过表达IMA肽的 植物显示一个或多个的微量元素，如铁、锌和/或锰水平的增加，这提高对动物的营养价值， 特别是在克服微量元素不足的问题上。还发现c-末端基序对IMA肽的功能是至关重要的，因 为重组IMA肽的C-末端基序删除可以使功能完全消失。操纵頂A肽的表达代表了一种新的用 于作物中的铁生物强化策略。
[0008] 具体地，在第一方面，本发明提供使用重组多核苷酸转化的转基因植物，所述重组 多核苷酸包含可操作连接至表达控制序列的编码铁调节多肽（即，如本文所用的MA肽）的 核苷酸序列，
[0009] 其中铁调节多肽包括C末端基序，所述C末端基序从N末端至C末端含有：
[0010] ⑶DDD(SEQ ID N0:1)的第一结构域，以及
[0011] DXAPAA(SEQIDN0:2)的第二结构域，
[0012] 其中第一结构域和所述第二结构域通过10个或更少氨基酸残基的肽间隔连接，
[0013] 其中，铁调节多肽包括长度总计20至100的氨基酸残基。
[0014] 在一些实施方案中，铁调节多肽提高植物中三价铁还原活性或能激活植物中用于 铁稳态的一个或多个转录因子，其选自AtbHLH38、AtbHLH39、AtFIT以及其任何组合。
[0015] 在一些实施方案中，转基因植物过表达铁调节多肽，且其微量元素含量高于对照 植物，其中微量元素选自铁(Fe)、锌(Zn)和锰(Μη)。
[0016] 在一些实施方案中，所述铁调节多肽包括长度总计20至90、25至85、或45至75的氨 基酸残基。
[0017] 在一些实施方案中，在所述铁调节多肽的第一结构域和第二结构域之间的肽间隔 具有总计1至6个或1至3个任意的氨基酸残基。
[0018] 在一些实施方案中，所述C末端基序含有氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID 恥：3、4、5、6、7、8、9和10。
[0019] 在一些实施方案中，所述铁调节多肽含有氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID N0:25、26、27、63、65、74、75、98和99。
[0020] 在第二方面，本发明提供如本文所述的转基因植物的植物组织或部分或植物细 胞。
[0021] 在第三方面，本发明提供用于产生转基因植物的方法，其包括(a)用含有编码本文 所述铁调节多肽的核苷酸序列的重组多核苷酸转化植物细胞，以及(b)使在(a)中获得的重 组植物细胞生长以产生转基因植物。
[0022] 在第四方面，本发明提供了用于生物强化的方法，其包括在表达铁调节多肽、足以 使转基因植物中微量元素含量增加的条件下使本文所述的转基因植物或其种子或其它繁 殖材料生长，其中所述微量元素选自铁(Fe)、锌(Zn)和锰(Μη)。
[0023] 在第五方面，本发明提供由本文所述的转基因植物、或其植物组织、植物部分或植 物细胞所制得的植物产品。本发明还提供含有所述植物产品的组合物，其可以是营养补充 剂或药物组合物，其用于在有此需要的受试者中补充微量元素。
[0024] 在第六方面，本发明提供了在受试者中补充微量元素的方法，其包括施用有效量 的如本文所述的转基因植物、由其制得的植物产品或含有此植物产品的组合物组合物。
[0025] 在一些实施方案中，本发明的方法有效地治疗由微量元素缺乏所导致的症状或疾 病，包括缺铁、缺锌或缺锰。在一些特定的实施例中，微量元素缺乏是缺铁，其导致贫血。 [0026]本发明的一个或多个实施方案的细节详见下文说明。从下文的若干实施方案的详 述及从所附的权利要求中本发明的其它特征或优点将将是显而易见的。
【附图说明】
[0027] 前面的概述以及本发明的以下详细描述在结合附图一起阅读时将更好理解。为了 说明本发明的目的，在附图中显示的实施方案是目前优选的。然而，应该理解的是，本发明 并不限于所示的精确安排和设备。
[0028] 在附图中
[0029] 图1A至图1B:显示鉴定G-D-D-D-D-间隔-D-x-A-P-A-A序列基序。图1A使用MEME组 件(24)鉴定的基序的序列标识。图1B图表显不序列基序的位置。
[0030] 图2A至图2G显示G-D-D-D-D-间隔-D-x-A-P-A-A基序对于頂A肽的功能是至关重要 的。图2A在35Spr 〇::MAlcDNA系中铁的积累。AtMAl异位表达导致叶青铜化(左图）。皮尔斯 染色显示与野生型相比的高铁浓度，特别是在叶脉中（中左）、根中柱（中右）、以及在胚芽中 (右图）。图2B在携带35Spr 〇: :MAlcDNA构建体的转基因植物中的过渡金属浓度，拟南芥叶 (左)和种子(右）。图2C胚芽的三价铁还原活性。在三个独立实验中使用3批次30个胚芽来确 定还原活性。误差棒表示平均值的标准误差。图2D具有MA基序的肽的氨基酸序列比对，所 述IMA基序由拟南芥（16，18)、西红柿（命名为3111^1 ;19)，水稻根/叶（命名为〇8頂六1和 Os頂A2;15)和大豆(命名为Gm頂Al-5;20)的铁响应基因所编码。图2E IMA1的活性结构域分 析。组成型表达AtIMAl或At頂A3编码序列（35Spro: :IMA1QRf)或嵌合AtIMAl基因的转基因植 物的三价铁还原活性，所述嵌合AUMA1基因在可变区具有删除（35Spr 〇::頂A1QRFA 1以及 35Spro::頂A1〇rfA2)或者在肽的保守C末端中具有删除（35Spro::頂A1〇rfA3)。图2F拟南芥 頂A1和頂A3的氨基酸序列比对。图2G拟南芥MA1、嵌合頂Α1 Δ 1、頂Α1 Δ 2和頂Α1 Δ 3的氨基 酸序列的比对，在过表达IMA1qrf、IMA3qrf以及具有删除的嵌合IMA1中的IMA1表达水平。
[0031 ] 图3A至图3E显示AUMA1表达模式的表征、亚细胞定位、以及过表达AUMA1在铁稳 态基因上的效果。图3A在不同植物部分相对At頂A1转录物丰度。图3B在响应磷和铁缺乏时 的AtIMAl的表达改变。图3C通过在拟南芥原生质体中表达35Spro: :IMA1:YFP构建体来确定 At頂A1的细胞内定位。证实YFP信号在核中和在细胞质中。图3D使用ATH1基因芯片通过微阵 列分析确定AtIMAl过表达对转录物谱的作用。图3E数字指超过1.5倍诱导的基因，P〈0.05。 [0032] 图4A至图4B显示在西红柿植物中异源表达At頂A1的效果。图4A果实中的过渡金属 浓度。图4B野生型（上）和35Spro::頂AIorf植物（下）的茎横截面的皮尔斯染色。误差棒表示 均值的标准误。
【具体实施方式】
[0033]除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属的技术领域中本领 域技术人员通常所理解的具有相同含义。
[0034] 如本文所使用的，单数形式"一"、"一个"和"所述"包括复数对象，除非上下文另有 明确说明。因此，例如，提及"一个组份"包括多个这样的组份和本领域技术人员已知的等同 物。
[0035] 术语"多核苷酸"或"核酸"是指核苷酸单元组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在 的核酸，例如脱氧核糖核酸（"DNA"）和核糖核酸（"RNA"），以及多核苷酸还包括具有非天然 存在的核苷酸的那些核酸类似物。多核苷酸可以被合成，例如，使用自动化DNA合成仪。术语 "核酸"通常是指大的多核苷酸。将会理解，当核苷酸序列由DNA序列（即4，1^，〇所表示时， 其还包括RNA序列（即六，1]，6,〇，其中"1]"代替"1'"。术语"(^财"是指以单链或双链形式与 mRNA互补或相同的DNA。
[0036]术语"互补"是指两个多核苷酸的相互作用面的拓扑兼容性或匹配在一起。因此， 两个分子可被描述为互补的，并且所述接触面表征是彼此互补的。如果第一多核苷酸的核 苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合伴侣的核苷酸序列相同，则第一多核苷酸与第二 多核苷酸互补。因此，序列5' -TATAC-3'的多核苷酸与序列是5' -GTATA-3'的多核苷酸互补。 [0037]术语"编码"指的是在多核苷酸(例如，基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特定序列作 为模板在生物