用于肝癌术后预后评估的试剂盒和肝癌化疗增敏剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种肝癌术后预后评估试剂盒和肝癌化疗增 敏剂。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌）是一种严重威胁我国 人民生命与健康的恶性肿瘤性疾病。在世界范围内，肝癌已经成为第三大癌症相关死亡原 因。近年以来，与肝癌相关的影像学诊断技术和外科手术技术不断提高。以sorafenib为代 表的肝癌靶向治疗药物也获得了美国食品与药品管理局的批准。这些成果为肝癌的诊断与 治疗提供了更多更有效的选择。但遗憾的是，综观当前肝癌临床治疗的现状，肝癌病人的术 后五年生存率并没有显著提高。
[0003] 目前，外科手术仍然是肝癌的首选疗法。但由于肝癌发病病程长，起病隐匿，一部 分病人在确诊时就已经错过了用手术的方法根治肝癌的最佳时机。术后预后不良的病人不 得不继续采取化学治疗的办法来巩固疗效。而不幸的是，肝癌细胞容易对化疗药物产生耐 药性，抗肿瘤药物化疗药物本身对机体也可能造成较大的毒副作用，故化学治疗的预后至 今仍难以令人满意。如能提高肝癌细胞对化疗药物的敏感程度，就可以减少化疗药物的给 药量而尽量地控制药物的毒副作用。故提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性也就成为肝癌临 床治疗的关键性难题之一。因此，为了给肝癌的早期预防、术后预后评价和化疗增敏提供新 的靶点，深入研究肝癌发生发展过程中涉及到的分子机理具有十分重大的意义。
[0004] 微小RNA(microRNAs，简称miRNAs)是一种长度约为20~25个核苷酸的非编码小 RNA^iRNA可以通过诱导mRNA降解或者抑制mRNA翻译等途径下调靶蛋白的表达水平。这类 非编码RNA参与了许多生理与病理过程。一些miRNA的表达异常则在包括肝癌在内的一系列 肿瘤性疾病的发生发展过程中扮演了重要角色。miRNA在肝癌的早期诊断、预后评估和靶向 性治疗等领域的特殊意义也正吸引着越来越多学者的关注。miR-653在2006年左右就被鉴 定到，但目前尚缺乏对其生物学功能的系统研究，对miR-653与肝癌发生和预后的相互关系 的认识亦尚不明确。
[0005] 迄今为止，尚未存在一种以miR-653为生物标志物的肝癌术后预后评估试剂盒，也 没有以miR-653为有效成分的肝癌化疗增敏剂。
【发明内容】
[0006] 本发明基于本领域存在的上述缺陷和空白，提供了一种以miR-653为主的肝癌术 后预后评估标志物，以及一种以miR-653为有效成分的肝癌化疗增敏剂。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 用于肝癌术后预后评估的试剂盒，其特征在于，包括用于定量检测待测肝组织中 微小RNA分子miR-653表达水平的试剂;所述miR-653的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示。 [0009 ]所述试剂包括实时定量PCR检测所述微小RNA分子miR-653所需的检测引物。
[0010] 还包括用于对微小RNA分子miR-653进行反转录的反转录引物，其序列如Seq ID No. 3所示。
[0011] 所述检测引物包括上游引物:5 ' -GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3 '，和
[0012] 下游引物：5' -GCGTTCGAACAGCTGCCT-3'。
[0013 ]还包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂。
[0014]采用上述试剂盒的方法中，所述PCR扩增的反应体系推荐为:2XAllinone? qPCR MixO. 5yL/yL，上游引物0.02μΜΛΛ，下游引物0.02μΜΛΛ，第一链cDNA 0.02μΜ/μL，其余为双 蒸水；
[0015]所述PCR扩增的反应程序推荐为:95度10分钟；以95度10秒，57度20秒，72度10秒为 一个循环，共30个循环。
[0016] -种肝癌化疗增敏剂，其特征在于，其有效成分包括人工制备的微小RNA分子miR-653 、 微小 RNA 分子 miR-653 的前体 ，或可在肝癌组织中 有效表达微小 RNA 分子 miR-653 和 /或 miR-653前体的过表达载体；
[0017] 所述微小RNA分子miR-653的核苷酸序列如Seq ID No. 1所不；所述微小RNA分子 miR-653前体由Seq ID No.2所示的DNA序列编码。
[0018] 所述过表达载体指真核表达载体或病毒载体；
[0019] 所述真核表达载体指pCMV-Myc表达载体、pEGFP表达载体或PCDNA3.0系列表达载 体；
[0020] 所述病毒载体指逆转录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。
[0021] 微小RNA分子miR-653在制备肝癌化疗增敏药物中的应用，所述微小RNA分子miR-65指人工制备的微小RNA分子miR-653、微小RNA分子miR-653的前体，或可在肝癌组织中有 效表达微小RNA分子miR-653和/或miR-653前体的过表达载体;所述微小RNA分子miR-653的 核苷酸序列如Seq ID No. 1所示;所述微小RNA分子miR-653前体由Seq ID No. 2所示的DNA 序列编码。
[0022] 所述过表达载体指真核表达载体或病毒载体；
[0023] 所述真核表达载体指pCMV-Myc表达载体、pEGFP表达载体或pcDNA3.0系列表达载 体；
[0024]所述病毒载体指逆转录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。
[0025]本发明发明人发现miR-653在正常肝组织中以及肝癌组织中的表达量上存在显著 差异，并发现过表达miR-653明显增强肝癌细胞对化疗药物sorafenib诱导凋亡的敏感程 度。基于这些发现，本发明供了一种用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括用于定 量检测待测肝组织中微小RNA分子miR-653的表达量所需的试剂。对于本领域技术人员而 言，定量检测一种已知的微小RNA分子的表达量可以有多种可选方法。比如可选实时定量 PCR，其中涉及引物设计，对于本领域技术人员而言，针对一段已知序列设计引物是常规实 验技能。
[0026] 在本发明的优选实施方式中，提供了一些用于实时定量per的引物，其中一对如 下：
[0027] 上游引物：5 ' -GTGTTGAAACAATCTCTACTG-3 ' ；
[0028] 下游引物：5 ' -GCGTTCGAACAGCTGCCT-3 '。
[0029]本发明提供的试剂盒还可以包括用于检测RNA表达量的其它常规试剂。
[0030] 还包括用于对微小RNA分子miR-653进行反转录的反转录引物，其序列如Seq ID No. 3所示。
[0031]基于发明人的发现，本发明还提供微小RNA分子miR-653在肝癌化疗增敏剂中的制 药用途。
[0032] 肝癌化疗增敏剂/药物中，以miR-653、和/或miR-653前体、和/或miR-653过表达载 体为有效成分。在一些具体的实施例中，所述miR-653过表达载体指，miR-653和/或miR-653 前体与载体连接的产物。miR-653的序列SEQ ID NO: 1由21个核苷酸组成，其末端核苷酸可 与靶基因 mRNA的3'非翻译区中相对应的靶向序列形成约7个核苷酸的碱基互补匹配，形成 种子序列（seed sequence)。
[0033] miR-653前体的序列SEQ ID N0:2,经适当的载体(可以选自一般真核表达载体或 者病毒相关载体)转染入哺乳动物细胞进行表达后，可被最终加工为成熟的miR-653(即SEQ ID N0:1 所示的RNA)。
[0034] 所述药物可以直接体内施用（in vivo途径）：miR-653或者编码SEQ ID No.2所示 的DNA的载体直接导入体内。这种载体可以是一般真核表达载体或者病毒相关表达载体，制 成制剂的DNA或RNA甚至是裸DNA或RNA。一般真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包 括但不限于pCMV-My c表达载体、pEGFP表达载体、pcDNA3.0系列表达载体等载体或者在已知 的表达载体基础上经改造而成的载体。
[0035] 所述肝癌术后预后评估试剂盒，还包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR 扩增试剂、针对miR-653的引物对和使用说明书。
[0036] 本发明请求保护上述试剂盒的制备方法，任何出于商业目的的制造和/生产所述 试剂盒的行为都落入本发明的保护范围。所述行为指，组装所述试剂盒的试剂中包括用于 PCR扩增miR-653的cDNA的引物;和/或，在标有肝癌术后预后评估用途的产品包装内放置用 于PCR扩增miR-653的cDNA的引物。
[0037] 需要的时候，本发明的所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。 所述"药学上可接受的载体"包括但不限于包囊剂、混悬剂、缓冲剂、乳剂、稀释剂、颗粒剂、 粘合剂、赋形剂、喷雾剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、透皮吸收剂、吸收促进剂、表面活性剂、着 色剂、矫味剂或吸附载体等。而所述药物可以制成包括但不限于注射液、片剂、胶囊剂、显微 注射剂、适于转染的剂型、粉剂、粒剂等剂型。以上提到的各种剂型药物均可依据药剂学领 域的常规方法制备。
[0038] 本发明中所述的"受试者"可以