用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶的制作方法

用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶的制作方法
【专利说明】用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶
[0001]相关申请的交叉引用 本申请要求保护2013年1月29日提交的美国临时申请号61/758,138和2013年3月14日 提交的美国非临时申请号13/803，804的权益，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明总体上涉及适于酶替代疗法的组合物，其包含人胱硫醚β-合酶(CBS)形式， 其可以显著地降低血清高半胱氨酸(Hey)浓度和增加下游代谢物例如胱硫醚和半胱氨酸的 产生。这样的组合物可用于治疗病况或疾病例如高胱氨酸尿症和高半胱氨酸再次甲基化障 碍。
[0003] 发明背景 CBS，在转硫作用途径中的一种重要的酶，在真核生物的高半胱氨酸(Hey)代谢中起重 要作用（Mudd等人，2001，载于THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE,第8版，第 2007-2056 页，McGraw-Hill, New York) <XBS酶催化丝氨酸和高半胱 氨酸的吡哆醛-5 磷酸(PLP;维生素 B6)-依赖性缩合以形成胱硫醚，该胱硫醚随后用于通 过另一种PLP-依赖性酶(胱硫醚γ-裂解酶)产生半胱氨酸。当CBS活性急剧降低或不存在 时，作为某些基因突变的结果，Hey在组织和血液中构建。在具有转硫作用途径的哺乳动物 细胞中，CBS在Hey再甲基化为甲硫氨酸或其在半胱氨酸的生物合成中的备选用途之间占据 了关键的调节位置。
[0004]在健康的正常个体中，CBS介导的从Hey到胱硫醚的转化为从甲硫氨酸(Met)代谢 成半胱氨酸(Cys)的限速中间步骤。维生素 B6为此过程的必需辅酶。在CBS酶中具有某些基 因突变的个体中，从Hey到胱硫醚的转化变慢或缺失，导致酶底物(Hey)的血清浓度升高以 及在酶产物(胱硫醚;Cth)的血清浓度相应降低。升高的Hey血清水平及其并发的向尿中的 排泄的临床病况，统称为高胱氨酸尿症。
[0005]对于高胱氨酸尿症的患病率的估计差异很大。新生儿筛查和临床确认的数据提供 1:200，000-1:335，000活产的范围(Mudd等人，2001)。来自丹麦、德国、挪威和捷克共和国 的新生儿DNA筛查研究的近期证据显示真实发病率可能高达~1:6,000 (Gaustadnes等人， 1999，N Engl J Med. 1340:1513;Linnebank等人，2001，Thromb Haemost. 85:986; Refsum等人，2004，Clin. Chem. 50:3;Sokolova等人，2001，Hum Mutat. 18:548)。另 外，近期工作已经指示CBS-缺陷型高胱氨酸尿症(CBSDH)个体具有精神病学的或心血管的 并发症，但目前未经诊断，因为缺乏典型地有助于诊断的特征性结缔组织缺陷（Li和 Stewart, 1999，Pathol. 31:221 ;Linnebank等人，2003，J. Inherited Metabol. Dis. 26: 509;Maclean等人，2002，Hum Mutat. 19:641)。与CBSDH相关的主要健康问题包括： 具有易于血栓形成倾向的心血管疾病，导致未经治疗和经部分治疗的患者中的高死亡率； 以进行性近视和晶状体异位影响视觉系统的结缔组织问题;影响骨骼的结缔组织问题，其 特征为马方综合征、骨质疏松症和脊柱侧凸；以及中枢神经系统问题，其包括智力迟钝和癫 痫。
[0006] CBS相关的高胱氨酸尿症的治疗解决方法取决于CBS基因中存在的突变类型。迄今 为止在人类中已经鉴定出CBS基因的大约160种致病性突变。与CBSDH相关的致病性突变的 性质中有功能性三分法(functional trichotomy)。一组突变被归类为"吡咳醇-响应的"， 其中CBS酶功能可以被高剂量维生素 B6治疗恢复。该治疗可以是有效的，但在这些个体中并 非总能减轻病理事件，在这些个体中一些事件甚至随时间而发生。第二组功能突变以"C-末 端CBS突变体"为代表，其缺乏响应由S-腺苷甲硫氨酸所致的翻译后上调的能力。具有这类 突变的个体通常缺乏智力迟钝和结缔组织方面的表型。在40岁之前的特发性血栓形成事件 后检测血浆Hey水平后检测到这类突变(Maclean等人，2002，Hum Mutat.19: 641-55)。最 后一组CBSDH突变是"传统的高胱氨酸尿症"，代表该病的最严重的形式。对于这后两组个 体，单独的维生素 B6治疗不能有效降低血清Hey水平。
[0007] 纯合的CBS缺乏的病理生理学无疑是复杂的，但有这样的共识:终末器官损伤的根 本诱因（instigator)就是血清Hey极度升高。在Hey的血液和组织浓度上的极大升高的毒性 可因 Hey本身的分子反应性和生物效应而产生，或者可因其影响大量生物过程的代谢物(例 如Hey-硫代内酯）而产生(Jakubowski等，2008，FASEB J 22: 4071-6)。慢性血小板聚集的 异常、血管参数的改变以及内皮机能障碍均已在患有高胱氨酸尿症的个体中描述。
[0008] 目前对于CBSDH的治疗存在三种治疗选项： 1) 在维生素 B6响应的患者中使用药理学剂量的维生素 B6来增加 CBS活性的残余活性； 2) 通过严格限制Met摄入的饮食来降低血清Hey;和 3) 通过甜菜碱介导的将Hey转化成Me t来解毒，从而降低血清Hey浓度。
[0009] 这3种疗法各自的目的在于降低血清Hey浓度。对于受维生素 B6无响应的CBSDH所 累的个体的标准治疗由补充以代谢配方和Cys(其在此情况下已成为条件必需氨基酸）的 Met-限制饮食组成。肉、乳制品以及富含天然蛋白质的其它食物的摄入被禁止。需要每日消 耗难吃的含氨基酸和微量营养物的合成代谢配方，以防止继发性营养不良。补充甜菜碱(商 品名：CYSTADANE?，同义词：三甲基甘氨酸）亦是标准疗法。甜菜碱充当用于在肝中通过甜 菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶催化的将Hey再甲基化成Met的甲基供体(Wi leken等，1983，N. Engl. J. Med. 309: 448-53)。即便在提供最佳护理和资源的医疗中心中，饮食遵从性通 常亦很差，并且这种非遵从性主要牵涉到高胱氨酸尿症的威胁生命的并发症的发展。
[0010] 以上部分所述的证据概述为以下要点： ?未经治疗的高胱氨酸尿症在血管、结缔组织和中枢神经系统中具有高的并发症率。
[0011] *降低血清Hey的治疗，例如严格Met限制饮食和甜菜碱，如果执行良好的话，减少 相关临床问题。认知表现上的改善需要在婴儿早期开始治疗。
[0012] *对饮食的遵从性一律很差。在新生儿期开始治疗的个体中，遵从性的减少发生 在青春期。在新生儿期之后开始治疗的个体中，遵从性在所有年龄段都很差。目前治疗方法 的极端困难在经历可通过饮食预防的威胁生命的症状、但仍然不能坚持该治疗的个体中是 很显然的。
[0013] *饮食遵从性的失败导致血清Hey增加，血管和结缔组织的并发症包括致命和失 能事件再现，并冒着严重副反应例如脑水肿（由于过度血清Met浓度)或严重营养不良（由于 缺乏必需氨基酸）的风险。
[0014] *最有效的治疗策略是增加酶活性，当将吡哆醇给予维生素 B6响应的高胱氨酸尿 症时是明显的。该策略对维生素 B6非响应的个体是无能为力的，因为这些个体中的突变状 态和增加的酶活性将取决于外源酶的递送，即酶替代疗法(ERT)(从未企图治疗高胱氨酸 尿症的一项策略）。
[0015] *在这三种现有治疗策略中具有已证明的功效：（1)在维生素 B6响应的个体中用 吡哆醇增加酶活性；（2)通过Met限制饮食减少累积代谢物;和(3)在甜菜碱治疗中通过甜 菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶的酶活性的解毒，所有都共同减低血浆中的总Hey (Walter， 等人，1998，Eur J Pediatr 157(Suppl 2): S71-6)〇
[0016] 另外，对于用于人类患者的所有现有治疗策略(除了 B6补充，其仅适合一部分高胱 氨酸尿症），高半胱氨酸的减少并不伴随Cth或Cys的增加。因为尚未确定过量Hey(而不是缺 乏下游代谢物)是临床症状的原因，因此限制在减少高半胱氨酸的现有治疗对于提供稳健 和有效治疗选项而言可能是不适当的。
[0017] 因此，本领域仍然需要对于高胱氨酸尿症的个体的更有效的治疗策略。
[0018] 发明概述 如本文所述，本发明提供用于尤其在高胱氨酸尿症的个体中降低血清Hey的组合物、尤 其是组合物、和方法。也提供的是组合物、尤其是药物组合物，其恢复基本正常的代谢物水 平，所述代谢物包括但不限于甲硫氨酸，例如半胱氨酸和胱硫醚。如本文中更具体描述的那 样，提供了用于高胱氨酸尿症的酶替代疗法(ERT)的试剂和方法，其中已对天然酶的修饰形 式进行重组工程改造，通过尤其提供改善的稳定性、活性和体内药物效用，以改善其药用可 接受性。
[0019] 在第一方面，本发明提供包含SEQ ID N0: 02的分离的CBS多肽，其中所述分离的 CBS多肽包含化学修饰并且是全长人CBS蛋白在氨基端、羧基端或在其氨基端和羧基端这两 端经遗传工程改造的截短物。在一个实施方案中，本发明提供人CBS的工程改造变体，其构 成C-末端调节区已被除去的重组人CBS (例如，rhCBSAC -该rhCBSAC在羧基端具有截短 的138残基并包含全长蛋白的551个氨基酸的氨基酸1-413) (SEQ ID N0: 3)。在某些实施 方案中，该种rhCBS △ C是突变的，在一个优选的实施方案中，截短的突变CBS是rhCBS Δ C-C15S (或缩写为"C15S" -该C15S在羧基端具有截短的138残基;与rhCBSAC相同）（SEQ ID NO: 13)，其中CBS氨基酸序列的位置15的半胱氨酸残基变为丝氨酸。在具体的实施方案中 本文公开的包括已经化学修饰的、尤其是通过与C-末端截短的重组人CBS (尤其是rhCBS Δ C)的聚乙二醇(PEG)部分共价连接的截短的重组人CBS种类。这些聚乙二醇化的种类分别称 为PEG-rhCBS Δ C或PEG-C15S。这些组合物(修饰的重组酶)和使用方法、尤其是如本文给出 的治疗用途，使得高胱氨酸尿症的个体可享受少得多的限制饮食(例如每日摄取2 g或更多 的蛋白质/kg)，并具有显著降低的Hey血浆水平和基本正常的代谢物水平(包括但不限于甲 硫氨酸，例如半胱氨酸和胱硫醚），导致长期的临床改善。
[0020] 有利的是，本发明使个体能达到对血清Hey水平的良好控制，而不用极端限制饮 食，后者具有不可接受的不遵从率。使用所述截短的种类，尤其是突变种类，尤其是所述 C15S突变体(聚乙二醇化的或同时突变和聚乙二醇化的）可有利地伴随个体的改善的代谢， 并因此改善临床结果，这体现在尤其与显著降低的血清Hey浓度相关的发病率和死亡率降 低。
[0021] 如本文公开的，C15S突变的人CBS种类有利地采用了这样的结构:其显著增加了在 体内的药物利用(例如，无可检测的聚集水平）X15S突变的人CBS种类也表现出高度可重现 的表达、纯化和聚乙二醇化模式，并且C15S突变减少了聚集的形成，因此通过改进回收而改 善了收率，并且能够更一致和可重现的聚乙二醇化。这些方面也可用于质量问题，这对于在 体内应用之前的步骤特别相关。
[0022]如本文公开的，相比非聚乙二醇化的截短变体、尤其是所述rhCBSAC或C15S种类， 聚乙二醇化的种类有利地具有增加的大小，其中聚乙二醇化的种类有减少的或延迟的清 除。另外，用PEG的化学修饰掩蔽了蛋白质表面上的潜在的免疫原性表位和阻碍了蛋白水解 酶接近该蛋白质。聚乙二醇化也有利地改变了rhCBS Δ C蛋白的理化性质，因此改变了其生 物分布、稳定性和溶解度，而不显著地损失其效力。
[0023] 根据以下发明详述和所附权利要求书，将会更充分地理解本发明的这些和其它特 征和优势。注意，权利要求书的范围受到其中的详述限定，而不受本描述中给出的特征和优 势的具体论述限定。
[0024] 本发明的附图简述 当结合下列附图阅读时，可最好地理解本发明的实施方案的下列详述。
[0025]图1阐明了在rhCBS Δ C聚乙二醇化后，血浆酶在体内的保留时间增加的实验证据。 图1提供了在单次给予rhCBS △ C和聚乙二醇化的rhCBS △ C后的药代动力学概况及其在体内 的稳定性的证据。图la是显示实验结果的柱状图，其中经由腹膜内（IP)、血管内（IV)或皮下 (SQ)途径给C57BL/6J小鼠注射5 mg/kg体重的人截短CBS (rhCBS Δ C)。将两个实验组(称为 1和2)的各5只小鼠用于每种注射途径(总共n=30)。对于每种注射途径，在注射后0、1、8和24 小时从组1采血，在注射后1、4、10和48小时从组2采血。用放射活性测定法(如实施例1所述） 分析血浆的CBS活性。图lb是在CBS从循环中清除后，如图la所述的每组的2只代表性小鼠血 浆中的CBS的蛋白质印迹分析结果的照片。CBS在12%凝胶上的SDS-PAGE分离和蛋白质印迹 到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，将膜用兔多克隆抗hCBS抗体探测，然后用缀合到辣根过氧化 物酶的第二抗兔抗体探测，然后条带用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce目录 号34077)显色。图lc是显示实验结果的柱状图，其中经由SQ途径给小鼠注射5 mg/kg体重的 ME020MA-或GL4-400MA-聚乙二醇化的rhCBS Δ C或非聚乙二醇化的rhCBS Δ CJE020MA代表 用ME020MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，GL4-400MA代表用GL4-