接近。本发明的组合物可通过常规方法来灭菌和/ 或冻干。
[0063] -类药学上可接受的载体包括控制释放制剂，其能够将本发明组合物缓慢释放到 个体或培养基中。本文使用的控制释放制剂包含在控制释放媒介物中的本发明的化合物 (例如，蛋白（包括同源物）、抗体、核酸分子、或模拟物）。合适的控制释放媒介物包括但不限 于生物相容性聚合物、其它聚合物基质、胶囊、微胶囊、微粒、推注制剂、渗透栗(例如，ALZET ?渗透栗）、扩散装置、脂质体、脂质球、和透皮递送系统。本发明的其它载体包括液体，当将 其给予个体后，在原位形成固体或凝胶。在具体的实施方案中，载体也是生物可降解的（即 生物可溶蚀的）。当所述化合物是重组核酸分子时，合适的载体包括但不限于脂质体、病毒 载体或其它载体，包括核酶、金颗粒、聚-L-赖氨酸/DNA-分子缀合物、和人工染色体。含天然 脂质的载体包括细胞和细胞膜。含人工脂质的载体包括脂质体和胶束。
[0064] 本发明的载体可以经修饰以靶向个体的特定位点，从而靶向和将本发明蛋白用于 该位点。能够靶向的药学上可接受的载体在本文中可也称为"递送媒介物"或"靶向载体"。 合适的修饰包括操纵递送媒介物脂质部分的化学式和/或将能够将递送媒介物特异性靶向 优选位点或靶位点(例如优选的细胞类型）的靶向剂引入媒介物。"靶位点"是指希望将组合 物递送到的个体中的位点。或者，所述药学上可接受的载体可包含适合将所述CBS蛋白递送 到动物(优选人)的血衆或血清中的试剂。合适的革G向化合物包括能够在特定位点选择性地 (即特异性地)结合另一分子的配体。这类配体的实例包括抗体、抗原、受体和受体配体。操 纵递送媒介物脂质部分的化学式，可调节递送媒介物的胞外或胞内靶向。例如，可将化学物 加入到脂质体的脂质分子式中，这改变脂质体的脂双层的电荷，使脂质体与具有特定电荷 特征的特定细胞融合。在具体的实施方案中，本发明的脂质体包括本领域技术人员已知的 常用于例如蛋白质递送方法的那些脂质体。可使用本领域标准方法，实现将脂质体与本发 明蛋白复合。
[0065] 再一方面，本发明涉及通过调节CBS的表达和/或活性而调节生物过程包括胱硫醚 产生的方法。该实施方案通常可包括使用（例如，给予）治疗用组合物，其包含一种或多种 CBS变体，尤其美国专利号8，007，787给出的其截短CBS变体和尤其是本文所述的SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 13,其可用于调节胱硫醚产生的方法，其可通过CBS的表达和生物活性 介导或与CBS的表达和生物活性有关。
[0066] 因此，在一个实施方案中，本发明的方法在动物和人类个体中调节胱硫醚产生，其 中保护所述个体免患以下疾病或治疗所述疾病:所述疾病与胱硫醚产生的调节有关，例如 高胱氨酸尿症和与其相关的病况/症状(例如，异位的眼睛晶状体、骨骼障碍、智力迟钝和早 产动脉硬化和血栓形成）。本文使用的词语"保护...免患疾病"是指减少疾病症状;减少疾 病的发生率，和/或降低疾病的严重程度。保护个体可以指本发明的治疗用组合物在给予个 体时预防疾病发生和/或通过减轻疾病症状、征兆或原因而治愈或治疗疾病的能力。因此， 保护个体免患疾病同时包括预防疾病的发生(预防性的治疗)和治疗患有疾病或经历疾病 的最初症状或晚期症状的个体(治疗性治疗）。术语"疾病"是指个体正常健康的任何偏离并 包括当疾病症状存在的状态，以及发生了偏离(例如，在非限制性实例中包括感染、基因突 变、和遗传缺陷等）、但症状尚未显现的状况(例如，疾病前状况）。
[0067] 更具体地讲，本文所述的治疗用组合物当通过本发明的方法给予个体时，优选地 产生一个结果，其可包括减轻疾病（例如，减少疾病的至少一种症状或临床表现），消除疾 病，减轻由原发性疾病的发生所致的继发性疾病，或预防疾病。在另外的方面，给予治疗用 组合物可以产生一个结果，其可包括在哺乳动物中增加转硫作用的下游代谢物的积累。
[0068] 依照本发明，有效给药方案（即以有效方式给予治疗用组合物)包括合适的剂量参 数和给药模式，其在个体中产生所需效果(例如，在个体中胱硫醚合酶活性增加或者丝氨 酸和高半胱氨酸缩合以形成胱硫醚增加），优选地保护个体免患疾病(例如，通过疾病预防 或通过减轻进行中的疾病的一种或多种症状）。可使用本领域用于具体疾病的标准方法确 定有效剂量参数。这样的方法包括例如确定生存率、副作用（即毒性)和疾病的进程或消退。
[0069] 依照本发明，合适的单剂量大小是这样的剂量：当在合适时间段给予一次或多次 时，导致正常蛋白质摄入的个体的CBS活性增加或控制Hey水平或个体的胱硫醚或半胱氨酸 形成的剂量，或导致个体病况的至少一种症状的改善的剂量。剂量可以不同，取决于所治疗 的疾病。根据个体大小和给药途径，本领域技术人员可以容易地确定对于指定个体的合适 的单剂量大小。
[0070] 在本发明的某些实施方案中，本发明治疗用组合物的合适的单剂量是这样的量： 当通过任何给药途径给予时，与未给予本发明治疗用组合物的个体相比（即预定对照个体 或测定），与给予所述组合物之前的个体相比，或与为具体疾病、个体类型和组合物而建立 的标准相比，所述量如上所述地增加 CBS活性。所给予的治疗用组合物在延长时间段具有酶 活性。该时间段优选超过24小时。经化学修饰治疗用组合物在24小时后保留所给予组合物 的起始活性的70%或更高。更优选所给予的治疗用组合物的酶促有效活性时间段超过48小 时。甚至更优选所给予的治疗用组合物的酶促有效活性时间段超过72小时。在某些实施方 案中，所述治疗用组合物可以在每天给予若干次(例如，2次、3次或更多次)或更低频率，包 括但不限于每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次或更低频率。在其它实施方案中， 所述治疗用组合物可以在数天、数周或数月连续给予。在本发明的另一实施方案中，合适剂 量的本发明的治疗用组合物可以与甜菜碱(例如CYSTADANE?)、更松弛的蛋白质限制饮食、 抗凝剂或他汀联合给予。
[0071 ]如上所述，将本发明的治疗用组合物给予个体，其方式能将所述组合物有效递送 到细胞、组织和/或系统给予个体，藉此达到给予所述组合物的所需结果。合适的给予方案 包括任何体内或离体给予方案。优选的给药途径是本领域技术人员显而易见的，取决于所 预防或治疗的病症类型；所述组合物是否是基于核酸、基于蛋白质或基于细胞;和/或靶细 胞/组织。对于蛋白质，体内给予方法包括胃肠外给予，尤其是包括但不限于，渗透栗给予、 静脉内给予、腹膜内给予、肌内给予、节内给予、冠状动脉内给予、动脉内给予(例如，到颈动 脉）、皮下给予、关节内给予、心室内给予、和直接注射到组织。可以采用递送途径的组合，并 且在某些情况下这类组合可增强组合物的疗效。
[0072] 许多上述给药途径，包括静脉内、腹膜内、皮内、肌内给予或通过渗透栗，可使用本 领域标准方法来进行。
[0073] 局部给药的一种方法是通过直接注射。直接注射技术尤其可用于将组合物给予到 细胞或组织（其是通过外科手术可进入的），和尤其是在体表上或其附近。将组合物局部给 予靶细胞区内，是指将组合物注射到距离靶细胞或组织几厘米、和优选几毫米处。
[0074] 局部给药的另一种方法是通过使用一个或多个渗透栗(例如，ALZET ?渗透栗），其 允许在延长时间段(例如数周或数月）内稳定地递送药物。植入的渗透栗尤其可用于将组合 物递送到细胞、组织或受试者(其是通过外科手术可进入的），和尤其是在体表上或其附近。 将组合物局部给予受试者的靶细胞或组织区内，是指将含有组合物的渗透栗植入到距离靶 细胞或组织几厘米、和优选几毫米处。
[0075] 在本发明的方法中，可将治疗用组合物给予脊椎动物类的哺乳动物的任何成员， 包括但不限于灵长类、啮齿类、家畜和宠物。家畜包括消耗型哺乳动物或生产有用产物的哺 乳动物(例如，用于生产羊毛的绵羊）。优选需要保护的个体包括人。
[0076] 本发明的一些方面包括使用分离的CBS多肽或本文所述的任何CBS变体，用于制备 非聚集的CBS衍生物。
[0077] 本文所描述和/或引用的各参考文献均通过引用全部结合到本文中。
[0078] 提供下列实施例是以说明为目的而无意限制本发明的范围。 实施例
[0079] 实施例1:在细菌中产生截短的CBS蛋白质 a.在细菌中重组表达截短的CBS蛋白 构建缺少非保守区的特定部分的截短的人CBS变体(rhCBSAC;SEQ ID No: 3)并使用 先前所述的基于大肠杆菌的表达系统过量表达(Kozich和Kraus，1992,出处同上）。编码所 述截短的人CBS蛋白变体rhCBSAC的构建体(编码rhCBSAC的DNA示于SEQ ID N0: 4)通过 修饰先前所述的PHCS3 CBS表达构建体(Kozich和Kraus, 1992，Hum. Mutat. 1:113-123) 来产生，所述构建体含有克隆到PKK388.1中的CBS全长编码序列（SEQ ID NO: 1)。为了产生 C端缺失构建体，使用将Sph I和Κρη I位点分别掺入PCR产物的5 '和3 '各端的引物扩增跨越 所需核苷酸残基的CBS cDNA片段。然后使用Sph I和Κρη I切开所有PCR产物并通过连接到 经Sph I和Κρη I消化的pHCS3载体来克隆。在CBS cDNA中天然存在一个Sph I位点，恰位于 反义引物杂交位点的上游(碱基对位置1012,根据CBS cDNA编号SEQ ID N0: 1)。然后使用 Nco I和Sph I消化如此产生的PCR产物并连接到经相同的酶切开的pHCS3质粒中。
[0080] pKK CBS A 414-551 有义：5'-CGTAGAATTCACCTTTGCCCGCATGCTGAT (SEQ ID NO: 5) (SphI限制位点为黑体） 反义：5'-TACGGGTACCTCAACGGAGGTGCCACCACCAGGGC (SEQ ID NO: 6) (Κρη I限制位点为黑体） 最后，将所述构建体转化到大肠杆菌BL21 (Stratagene)中。按照制造商的说明书，通 过使用Thermo Sequenase Cy5.5测序试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech)和Visible Genetics Long-Read Tower System_V3.1 DNA测序仪的DNA测序来验证构建体的可靠性。 [0081 ]对于CBS缺失突变体的细菌表达分析，依照先前所述(Maclean等人，2002, Hum. Mutat. 19:641-55)，培养含CBS截短突变构建体的大肠杆菌BL21细胞，诱导表达并产生粗 细胞裂解物。
[0082]也使用一种替代方法，在pET28a ( + )载体中制备序列-优化的、截短的人CBS酶 (rhCBSAC;SEQ ID No: 3)。对于细菌表达而优化全长(551 aa)人CBS编码序列并将该序列 克隆到PUC57载体，然后用GenScript USA Inc. (NJ，USA)的EcoRV限制酶消化。再将CBS序 列通过PCR扩增，使用引物A1和A2,产生编码截短酶的序列(aa 1-413): 引物： A1 5' agtcgcCCATGGcgtcagaaaccccgcag 3' （SEQ ID N0: 7) Ncol限制位点在帽子(CAP)中。黑体G突变为C (对于脯氨酸）。
[0083] A2 5' atcgcgCTCGAGttagcgcaggtgccaccac 3' （SEQ ID N0: 8) Xho I限制位点在帽子(CAP)中，接着是TTA，是终止密码子。
[0084] 再将PCR产物用限制酶Nco I和Xho I消化，并连接到已经相同酶消化的pET_28a (+) 载体（可购自EMD Millipore, Billerica, ΜΑ)。克隆到pET-28a( + )的优化Ncol位点，相比 CBS野生型序列，导致G-C突变(编码丙氨酸替代脯氨酸）。因此，使用引物B1和B2的定点诱 变试剂盒(Stratagene, CA, USA)用于再次产生野生型序列，以编码脯氨酸： B1 5' GGAGATATACCATGCcgtcagaaaccccgc 3' （SEQ ID N0: 9) B2 5' GCGGGGTTTCTGACGGCATGGTATATCTCC 3' （SEQ ID NO: 10) 相同策略用于产生C15S突变体(T-A突变），通过使用引物： C1 5'- TGGGTCCGACGGGT4GCCCGCAC -3' （SEQ ID N0: 11)和 C2 5' - GTGCGGGCTACCCGTCGGACCCA - 3' (SEQ ID NO: 12)〇 [0085]通过测序证实经优化的rhCBS Δ C和C15S突变体多核苷酸构建体的完整序列。
[0086]在pET_28a( + )载体中，截短CBS的表达受到上游T7启动子的控制，并且需要转化到 DE3细菌中并通过IPTG诱导。
[0087] b.序列-优化的、截短的人CBS酶的表达 将携带编码截短的人CBS的序列的pET-28a( + )载体转化到DE3细菌，即HMS174(DE3)或 BL-21(DE3)，并选择卡那霉素抗性克隆并作为母液甘油维持在-80°C，供进一步使用。
[0088] 在37°C，将来自母液甘油的细菌在含有30 ug/ml卡那霉素的5 ml Luria-Bertani (LB)培养基中在275 RPM旋转摇床上培养过夜。第二天早上，将1 ml过夜培养物加入到含有 30 ug/ml卡那霉素的100 ml Terrific Broth (TB)培养基中并如上所述地培养过夜。再将 10 ml过夜培养物加入到含有以下补充剂的1升TB培养基中： * 0.001%盐酸硫胺素 pH 8.0 * 0.0025%盐酸吡哆醇pH 8