一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明专利涉及一种中试化生产重组腺相关病毒的新技术，尤其涉及一种利用 WAVE波浪式生物反应器进行293系列细胞微载体培养和重组腺相关病毒包装实现病毒中 试化生产的技术，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 腺相关病毒（Adeno associated virus, AAV)是目前世界公认的安全，可靠的基因 传递载体，已在众多临床研究和应用中得到进一步的见证，包括帕金森病和阿尔茨海默病 在内的一些脑部疾病、血友病、肌肉萎缩、心脏衰竭乳腺癌、肺癌等肿瘤和先天性失明眼疾 病中都有很好地治疗。
[0003] 近两年来国家自然科学基金涉及基因治疗的技术方法中有关AAV的研究比例上 升3~5倍之多。以及一些如中国人民解放军总医院、西南医院、云南省肿瘤医院、上海肿 瘤医院等大型医院对AAV载体基因治疗临床方案和生产应用均具有强烈的市场需求；同时 国内一些药物研发企业已有AAV治疗方案，且已进入大规模动物体内实验阶段或临床前药 物阶段。由此看来，未来几年随着全球大型药企的新药逐步大量进入临床阶段而推向市场， 以及国内药企的新药研究也将陆续进入大动物（狗和猴）体内给药实验阶段和临床前试验 阶段。因此，对AAV基因载体的市场需求将呈爆发式增长。
[0004] 目前，腺相关病毒载体的生产多是利用转瓶方式进行病毒包装细胞的培养，然后 实施手动细胞转染来完成病毒包装。转瓶培养细胞增殖缓慢且生产过程中对细胞的培养条 件如pH，通气溶氧、培养液成分等难以监控和适时补给，无法提供细胞最适增殖条件，劳动 强度大，自动化程度低；手动细胞转染容易出现转染不稳定，转染效率低等情况易产生认为 误差。再加上转瓶培养时培养条件的不可控性，导致批量间细胞活力差异性大、不稳定等， 易引起病毒包装生产过程中出现产病毒的滴度低或者不产毒现象。此外，利用转瓶培养和 人工手动细胞转染不适合大批量生产病毒载体，如要实现病毒的大量生产只能通过增加转 瓶数量的方法，结果导致车间规模、设备、人员的大量投入。而用生物反应器进行病毒包装 细胞培养则可以克服上述的不足，同时在生物反应器内实施病毒包装细胞的转染过程，不 仅充分提高了生物反应器的利用效率，也增加了设备的生产能力，更加有利于实现病毒载 体的中试化生产。
[0005] WAVE波浪式生物反应器采用非介入式的波浪混合方式，提供温和低剪切力高溶氧 的细胞培养微环境，有利于提高细胞密度、改善细胞状态，易于线性放大。无菌细胞培养袋 培养体积灵活、操作简单、有效降低污染风险，从而缩短工艺开发周期，提高产能。
[0006] 采用WAVE波浪式生物反应器进行重组腺相关病毒包装细胞培养和病毒细胞的转 染以实现中试化生产病毒。其中所使用的微载体类型、加入的微载体含量，细胞接种密度， 培养袋中培养液的体积以及培养袋的摇动转速等均影响到病毒包装细胞的生理活性，进而 影响到后续的病毒产毒能力和产毒效率，在生产实践中需要对上述培养技术和条件进行优 化。
【发明内容】
[0007] 本发明专利的目的是利用WAVE波浪式生物反应器进行微载体培养293系列病毒 包装细胞来中试化生产重组腺相关病毒的技术。该技术通过对所使用的微载体类型、加入 的微载体含量，细胞的接种密度，培养袋中培养液的体积以及培养袋摇动的转速等进行优 化，有效地保持细胞稳定性，提高病毒的滴度和产毒效率，满足更广大客户需求，节省大量 人力资源的消耗。
[0008] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0009] 一种利用WAVE波浪式生物反应器进行293系列病毒包装细胞微载体培养实现重 组腺相关病毒中试化生产的新技术，包括：（1)细胞培养：将293系列细胞接种到细胞培养 袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；(2)病毒包装：沉降微载体， 加入新鲜细胞培养基、细胞转染试剂和病毒包装所用三质粒体系，进行共转染后继续培养 细胞实现病毒包装；（3)病毒分离与纯化：细胞培养结束后，通过离心、抽滤或过滤的形式 收集上清，利用AKTA蛋白核酸层析系统进行病毒的分离纯化；(4)病毒滴度测定：利用荧光 定量实时PCR仪检测病毒的基因组拷贝数来测定病毒滴度。
[0010] 采用WAVE波浪式生物反应器培养293系列细胞时，培养袋中培养液的装液量影响 细胞培养过程中的溶氧；摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有明显的 影响，为了确定最适宜的装液量和摇动培养参数，本发明对培养袋中培养液的装液量、摇动 培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对细胞生长 的影响。通过实验发现，培养液的装液量为50%~65% (v/v) WAVE摆动角度是8~15°， 摆动速度是10~15rpm时，细胞生长状态最佳，细胞产量最高。
[0011] 微载体类型影响细胞与微载体间的吸附作用力，细胞只有被吸附方可实现增殖； 同种材料的微载体不同粒径影响微载体的比表面积，影响吸附细胞的数量进而影响细胞的 生长特性。Cytodexl 适用于通用微载体培养（general purpose microcarrier culture)， 尤其适用于大多数已建立的细胞系（established cell lines)。Cytodex2适用于病毒，原 代细胞或成纤维二倍体细胞的培养；CytodeX3是用于某些难以生长的细胞、分化细胞培养 系统、尤其是具有上皮样形态学特征细胞的首选微载体。
[0012] 在固定每克微载体接种相同细胞数的前提下，本发明考察微载体Cytodex 1、 Cytodex 2和Cytodex 3对细胞生长的影响，确定适合的微载体为Cytodex 1和Cytodex 3〇
[0013] 此外，细胞接种密度与微载体含量对细胞生长也有显著影响，其中重要的是细胞 接种密度与微载体的比例关系。本发明考察微载体Cytodex 1和Cytodex 3,用量均设置 为 lg/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，细胞接种密度设置为 1 X 105个 /mL，3 X 10 5个 /mL, 5 X 105个 /mL, 7 X 10 5个 /mL, 1 X 10 6个 /mL, 3 X 10 6个 /mL, 5 X 10 6个 /mL,确定细胞接 种密度为3X 105~1 X 10 6个/mL，微载体的用量为2~5g/L时，细胞生长密度较高。
[0014] 利用实用新型专利（CN201520715680. 5)中提到的一种用于实现磷酸钙法快速批 量转染细胞的装置，进行细胞转染试剂和病毒包装所用三质粒系统适当比例混合，然后再 将混合液栗入WAVE反应器内与所培养的病毒包装细胞混合进行细胞转染和细胞培养，并 完成病毒包装，获得高滴度的病毒。
[0015] 利用AKTA purel50蛋白核酸层析系统进行病毒的分离纯化，获得高纯度的病毒。
[0016] 本发明技术优化了重组腺相关病毒中试化生产的工艺参数，提高了 293系列病毒 包装细胞的培养效率，进行了病毒包装细胞的半自动化批量转染，获得了高滴度、高纯度的 重组腺相关病毒，实现了病毒的中试化生产。
【附图说明】
[0017] 图1为WAVE反应器微载体培养293系列细胞光学显微镜图（放大倍数为10 X 10)
[0018] 图2为293系列包装细胞转染后白光显微镜图（放大倍数为4X 10)
[0019] 图3为293系列包装细胞转染后荧光显微镜图（放大倍数为4X 10)
[0020] 图4重组腺相关病毒AKTA分离纯化图
【具体实施方式】
[0021] 结合具体实施方案进一步描述本发明，这些实施例仅为范例性，并不对本发明的 范围构成任何限