的影响
[0049] 实验例4. WAVE反应器摇动条件的优化实验
[0050] WAVE反应器摇动条件，即摇动角度和摇动速度，一方面影响到细胞生长的溶氧，另 一方面不同的摇动条件对细胞的剪切作用力大小不同，影响细胞的完整性并影响细胞的最 终密度。实验以3g/L的含量加入微载体cytodex 1，以3. 5X105个/mL密度接种293TN 细胞，加入细胞DMEM培养基，装液量固定为50% (v/v)，摆动角度分别为8°，10°，12°， 15。，16° ;摆动速度分别为lOrpm，12rpm，15rpm，18rpm，20rpm，间隔24h取样，更换新鲜培 养基继续培养至72h，观察微载体上细胞吸附和生长情况并进行细胞计数，考察摇动条件对 细胞培养的影响。
[0051] 实验结果见表4。由表可知，整个培养过程中，摇动条件对细胞密度影响较大。从 实验结果可看出，当摇动条件为摆动角度为8~14°，摆动速度是10~15rpm时，细胞生 长状态良好，细胞密度成增加趋势，培养48h细胞的最终密度可达10 6个/mL的数量级，基 本可满足后续病毒包装的细胞用量。当转速继续增加时，细胞的终密度下降，培养液变得粘 稠，原因可能是转速增加导致细胞破碎引起。因此，本发明优选的摇动条件为摆动角度8~ 14°，摆动速度是10~15rpm。 表4.摇动条件对细胞生长的影响
[0052] 实验例5. WAVE反应器装液量的优化实验
[0053] WAVE反应器内培养基的装液体积一方面影响到细胞对营养物的需求，另一方面也 影响到细胞生长所需的溶氧。实验以3g/L的含量加入微载体cytodex 1，以3. 5X 105个/ mL密度接种293TN细胞，加入DMEM培养基，装液量为30 %，40 %，50 %，60 %，70 % (v/v)， 摆动角度分别为10° ;摆动速度分别为12rpm，间隔24h取样，并更换新鲜培养基，继续培养 至72h结束。观察微载体上细胞吸附和生长情况并进行细胞计数，考察摇动条装液量件对 细胞培养的影响。
[0054] 实验结果见表5。由表可知，在固定摇动条件、固定微载体用量和固定接种的细胞 密度进行293TN细胞培养时，装液量对细胞生长的影响不是太显著。从实验结果可看出，当 摇动条件为摆动角度为10°，摆动速度是12rpm，接种密度为3. 5X 105个/mL时，随着装液 量的增加，培养过程中细胞密度增加，但增加不显著。而当装液量40%~60%之间培养 时，细胞培养48h即可获得10 6个/mL数量级的细胞密度，可满足后续病毒包装的细胞用量， 因此，本发明优化的培养基装液量为40%~60%。 表5.摇动条件对细胞生长的影响
[0055] 实验例6.利用WAVE反应器在优先条件培养293TN细胞进行腺相关病毒中试化生 产
[0056] 根据以上各优化实验中细胞生长的结果，在优化条件下，WAVE反应器培养293TN 细胞进行腺相关病毒中试化生产。WAVE反应器摆动角度为10°，摆动速度是12rpm，微载体 用量为3g/L，接种的细胞密度为5 X 105个/mL，装液量为50%的条件下，培养细胞至48h结 束并计数。放出反应器内的培养液，保留细胞，依据所记录的细胞密度，加入新鲜DMEM培养 基和适当比例的病毒包装三质粒系统，进行转染6~8h，转染结束后吸取培养基加入新鲜 DMEM培养基，继续培养72h~120h，每间隔24h更换一次新鲜培养基；培养结束即完成病毒 包装过程，收集上清液进行病毒粗提液的滴度测定。
[0057] 病毒滴度测定利用Q-PCR仪进行，测定结果如表6所示。 表6不同批次WAVE反应器培养细胞生产出的不同血清型腺相关病毒物理滴度测定结 果
【主权项】
1. 一种利用WAVE波浪式生物反应器进行293系列病毒包装细胞微载体培养实现重组 腺相关病毒中试化生产的新技术，包括：（1)细胞培养：将293系列细胞接种到细胞培养袋 中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2)病毒包装：沉降微载体，加 入新鲜细胞培养基、细胞转染试剂和病毒包装所用三质粒体系，进行共转染后继续培养细 胞实现病毒包装；（3)病毒分离与纯化：细胞培养结束后，通过离心、抽滤或过滤的形式收 集上清，利用AKTA蛋白核酸层析系统进行病毒的分离纯化；（4)病毒滴度测定：利用荧光 定量实时PCR仪检测病毒的基因组拷贝数来测定病毒滴度。2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装细胞为293系列细胞。3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微载体为Cyodex1和Cyodex3。4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微载体在细胞培养袋中的含量为3~5g/ L〇5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：培养袋中培养液的装液量为40%~60% (v/v)〇6. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将细胞按照3X10 5~1X10 6个/mL的接 种密度接种到细胞培养袋中的微载体上。7. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的细胞培养条件为，WAVE反应器摆动 角度是8~15°，摆动速度是10~15rpm。8. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装为采用细胞与三质粒 共转染的方式，三质粒分别为辅助质粒I，辅助质粒II和重组质粒III，且三者使用比例为 1:3:1〇9. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装为首先是细胞转染试剂 与病毒包装三质粒系统的混合，细胞转染试剂与三质粒系统混合比例为20:1~30:1。10. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的病毒包装为三质粒共转染细胞方 式，所用转染方法为磷酸钙法，细胞与转染体系(细胞转染试剂与三质粒系统的混合液）的 使用比例为4X106个细胞：1ml转染体系。11. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述病毒的分离纯化为使用AKTA蛋白 核酸层析系统，适合的层析条件为填充料选用Qsphorase,流速为0. 2ml/min~100ml/ min，平衡上样缓冲体系为20mMol/LpH8.0的Tris-HCl，洗脱体系为内含终浓度为0. 5 Mol/LNaCl的 20mMol/LpH8. 0 的Tris-HCl缓冲液。12. 由权利要求1-10任何一项所述方法可实现腺相关病毒的中试化生产。13. 权利要求11所述的中试化生产的重组腺相关病毒可用于基因治疗遗传缺陷性疾 病包括乳腺癌、肺癌、肝癌等肿瘤、先天性视神经疾病、遗传性心肌等疾病。
【专利摘要】本发明公开了一种利用WAVE波浪式生物反应器进行293系列细胞微载体培养和病毒包装实现中试化生产重组腺相关病毒的新技术，包括：（1）细胞培养：将293系列细胞接种到细胞培养袋中微载体上，加入培养基，摇动培养袋；（2）病毒包装：沉降微载体，加入新鲜培养基、转染试剂和病毒包装所用三质粒体系，共转染后继续培养细胞实现病毒包装；（3）病毒分离纯化：培养结束后，离心、抽滤或过滤收集上清，用AKTA蛋白核酸层析系统分离纯化病毒；（4）病毒滴度测定：用Q-PCR仪测定病毒滴度。该技术可实现细胞自动规模化培养、实现细胞转染及病毒包装、实现重组病毒中试化生产，满足更广大科研用户，缓解病毒载体市场供需矛盾，减少人力成本投入。
【IPC分类】A61P35/00, C12N7/02, A61K48/00, A61P27/02, C12N7/01, A61P9/00
【公开号】CN105483092
【申请号】CN201510654289
【发明人】胡惠忠, 陈国泽, 杨兴林, 蔡永超, 贾翠英, 潘讴东, 祖勇, 夏清梅, 殷珊
【申请人】和元生物技术（上海）股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年10月10日