Pten基因干扰慢病毒载体及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] PTEN又名MMAC1/TEP1，是1997年由三个独立的研究小组几乎在同一时间克隆出来 的一种抑癌基因。据Li J.Yen C.LiawD.et al.PTEN，aputative proteintyrosine phosphatase gene mutated inhuman brain. breast and prostate cancer[J] .Science. 1997, 275(28):1943-1947,中报道用代表性差别分析法 (representationaldifference analysis，RDA)，在浸润性乳腺癌的两个移植瘤中发现了 10q23染色体特定区域的纯合性缺失，并通过外显子俘获分析法(exontrap analysis)分离 出一种新的基因，对其开放阅读框架(0RF)序列分析揭示了它可能编码蛋白质酪氨酸磷酸 酶（PTP)，且与张力蛋白，辅助蛋白有大片同源区，因此将其命名为PTEN(ph 〇SphataSe andtensin homology deleted on chromosome 10)。同时，由于10q23L0H在胶质母细胞瘤 中的频率为70 %左右，Steck等对此现象研究时，亦从其细胞系中克隆得到亚定位于 10q23.3，于多种进展期癌中突变的基因，称之为MMAC1之后不久，在搜索PTPs家族新成员过 程中又获得一受TGF-fH周节、上皮细胞富含的磷酸酶基因 TEP1，（TGF-f3regulated and epithelial cell-enriched phosphatase)，详见 SteckPA.Pershouse MA . Jasser SA.etal. Identification of a candidate tumor suppressor gene .MMAC 1.atchromosome 10q23.3that is mutated inmultip le advanced cancers[J].Nat Genet，1997，15(4): 356-362 ·在比较PTEN、MMAC1和TEP1三者cDNA及编码的蛋白后将其归为 同一基因。随后文献中多以PTEN或PTEN/MMAC1的形式出现。PTEN基因异常广泛存在于人类 各种恶性肿瘤中，如恶性神经胶质瘤、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、黑色素瘤等。PTEN基 因正常表达可以抑制肿瘤细胞侵袭、转移和生长，该基因异常将导致PTEN蛋白表达下降甚 至完全不表达。PTEN基因失活与细胞信号转导、肿瘤发病机理、浸润转移、恶性转化、无限制 生长和临床预后等有较为密切的关系。
[0003] PTEN基因定位于第10号染色体10q23.3区，有9个外显子，其cDNA序列内包含一个 由1209个核苷酸组成的开放阅读框，第5个外显子编码第122~123位氨基酸，该编码序列与 蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶催化区的核心基序符合，是迄今为止 发现的第一个编码具有双重特异磷酸酶功能的抑癌基因。同其它抑癌基因一样，PTEN为一 高度保守基因，人、小鼠、犬的PTEN序列有99.75%的同源性，在细胞的分化中起着重要的作 用。PTEN编码一个由403个氨基酸组成的一条肽链，PTEN蛋白没有SH2结构，也没有跨膜信 号，它是定位于细胞浆的一种磷酸脂酶。PTEN蛋白的氨基酸序列氨基端与细胞骨架蛋白 tensin和神经触突泡转运相关蛋白auxilin高度同源，提示PTEN在维持细胞的结构和信号 转导中起重要作用。PTEN基因具有双重磷酸酶活性，即蛋白酪氨酸磷酸酶活性和脂质磷酸 酉每活性，SimpsonL · Parsons R. PTEN: 1 if e as a tumor suppressor [J] .Exp Cell Res. 2001，264( 1): 29-4 1.报道PTEN主要是通过脂质磷酸酶发挥抑癌作用。磷脂酰肌醇-3， 4,5_三磷酸[PtdIns(3,4,5)P3,简称PIP3]是PTEN作用的主要底物，PIP3是细胞生长因子的 第二信使，其在细胞膜上地聚集能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。而PTEN可以使其脱磷 酸，降低细胞内的PIP3水平，阻断其后的传导通路，使细胞周期阻断在G1期或促使细胞凋 亡，对细胞的生长起负调节作用。当PTEN基因发生体细胞突变或丢失而失活时，导致细胞内 PIP3的水平增高，其后的信号传导加强，使细胞无限增殖形成肿瘤。此外，PTEN基因也具有 蛋白酪氨酸酶活性，使磷酸化的酪氨酸和丝氨酸局部粘连激酶(FAK)脱磷酸，抑制整合素介 导的细胞浸润和转移。
[0004] 在人类大多数恶性肿瘤中，均有抑癌基因的突变，如P53、PTEN、P16、BRCA1、BRCA2、 Rbl等。PTEN是迄今为此发现的第一个具有双重磷酸酶功能的抑癌基因，在人类的恶性肿瘤 中广泛存在突变(约25~50%)，如恶性神经胶质细胞瘤、黑色素瘤、头颈癌、肾癌等，尤其是 在甾体激素依赖性肿瘤中如前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢子宫内膜样癌、乳腺癌等，而PTEN 基因在子宫内膜癌中的突变是所有恶性肿瘤中检出率最高的，同时也是至今在子宫内膜样 腺癌中鉴定出的最常见的突变基因，突变率在36 %~83 %，在子宫内膜癌前病变中也发现 有18~55%的突变率。
【发明内容】
[0005] (一)解决的技术问题
[0006] 针对现有技术不足，本发明提供一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法，制 备了 PTEN基因干扰慢病毒载体，转染He 1 a细胞，He 1 a细胞内PTEN基因的表达都有显著下调 作用。
[0007] (二)技术方案
[0008] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
[0009] 一种PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
[0010] S1、利用Age I和EcoR I酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的 载体质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，再用冷却 的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取180-200μ1转移到无菌的微量离心管中，4只离心 管分别加2-4μ1连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；
[0011] S2、将步骤S1中处理后的4只离心管放到预加温到40-45°C的循环水浴中放好的试 管架上，静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却1-2分钟；
[0012] S3、向上述4支离心管中分别加800μ1 S0C培养基，用水浴将培养基加温至37°C，然 后将离心管转移到37°C摇床上，温育42-46分钟使细菌复苏，再将150μ1已转化的感受态细 胞转移到含20mmol/L MgS04和Amp抗性的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸 收，倒置平皿，于37°C培养，16小时；
[0013] S4、将4个siRNA干扰片断连接pGCSIL-GFP质粒的PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别 阳性克隆和阴性克隆，并挑选阳性克隆测序。
[0014] 优选的，步骤S1所述利用Age I和EcoR I酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收 酶切线性化后的载体质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP 连接，再用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μ1转移到无菌的微量离心管 中，4只离心管分别加2μ1连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
[0015] 优选的，步骤S2所述4只离心管放到预加温到42°C的循环水浴中放好的试管架上， 静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却2分钟。
[0016] 一种PTEN基因干扰慢病毒载体，所述载体转染Hela细胞，利用Real-time PCR，对 PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行检测。
[0017 ]优选的，所述He la细胞内PTEN基因的表达有下调作用。
[0018](三)有益效果
[0019 ]本发明提供一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法，制备了 PTEN基因干扰慢 病毒载体，分别将4个siRNA干扰片断，通过酶切位点与载体连接后，通过PCR产物凝胶电泳 鉴别挑选阳性克隆测序，还与pHelper 1.0、pHelper2.0两种包装质粒共转染293T细胞培 养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，再利用Real-time PCR，对4个PTEN基因干扰载 体质粒对目的基因干扰效果进行了检测，结果显示，四个靶点对Hela细胞内PTEN基因的表 达都有显著下调作用，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85%，为进一步大量扩增提 取病毒奠定了基础。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明质粒简化图；
[0021] 图2为本发明辅助质粒简图；
[0022] 图3为本发明PCR产物凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆图；
[0023]图4为本发明Real-time PCR检测四个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效 果图；
【具体实施方式】
[0024]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清