Forward primer-0·4μ1，Reverse primer-O·4μ1，ddH20_8·2μ1，cDNA_lyl;
[0141] (4)不同转染组样品曲线扩增：用反应Buffer将样品cDNA 1:10倍稀释，按与标准 曲线同样的反应体系和反应条件扩增。每个稀释浓度做两个重复管，结果取平均值。用标准 曲线测定细胞PTEN的mRNA水平上的表达量，以PTEN/GAPDH表示细胞中的PTEN基因在mRNA水 平上的相对表达量，对比不同组的相对表达量即可检测PTEN的变化情况。
[0142] 6实验结果
[0143] 图1所示为PTEN干扰质粒(pGCL-GFP)，基因干扰片段（即shRNA茎环结构)插入MCS 区，由U6启动子驱动表达，后接PCMV启动子驱动表达绿色荧光蛋白（GFP)。
[0144] 图2中，pHelper 1.0:该质粒中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋 白；P〇l基因，编码病毒特异性的酶;rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。
[0145] pHelper 2.0:该质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需 要的包膜蛋白。
[0146] 6.1 PTEN基因干扰慢病毒载体的制备及目的基因干扰效果
[0147] 分别将四个siRNA干扰片断，通过酶切位点与载体连接后，通过PCR产物凝胶电泳 鉴别挑选阳性克隆测序(连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为343bp，如图3所示）。 最后利用Real-time PCR，四个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行了检测，结 果显示，四个靶点对He la细胞内PTEN基因的表达都有显著下调作用。其中KD3#是最佳靶点， 相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85%。因此选择使用连接#3干扰序列的基因干扰 载体，并大量扩增提取病毒备用（如图4所示）。4个siRNA干扰片断连接pGCSIL-GFP质粒的 PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆测序。PCR条带大小:连接入vshRNA片段的阳 性克隆PCR片段大小为:343bp(从载体中切掉24bp);没有连接入vshRNA片段的空载体克隆 PCR片段大小为：306bp。# 1:阴性对照（ddH20); #2:阴性对照（空载组）；#3: Marker; #4，6，7，8 为阳性克隆;#5:阴性克隆。
[0148] 6.2 Real-time PCR检测四个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果。
[0149] 如图4所示，Real-time PCR检测结果显示：四个革巴点对Hela细胞内目的基因的表 达都有显著下调作用。其中KD#3是最佳靶点，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到 85%。因此选择使用连接#3干扰序列的基因干扰载体，并大量扩增提取病毒备用，为进一步 大量扩增提取病毒奠定了基础。
[0150] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实 体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存 在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖 非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要 素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备 所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在 包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0151] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者 替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
[0152] siRNA 片断 1:
[0153] CcggaaGATCAGCATACACAAATTATTCAAGAGATAATTTGTGTATGCTGATCttTTTTTg；
[0154] aattcaaaaaaaGATCAGCATACACAAATTATCTCTTGAATAATTTGTGTATGCTGATCtt；
[0155] s iRNA 序列：GATCAGCATACACAAATTA
[0156] siRNA 片断 2:
[0157] CcgggaCCAATGGCTAAGTGAAGATTTCAAGAGAATCTTCACTTAGCCATTGGtcTTTTTg；
[0158] aattcaaaaagaCCAATGGCTAAGTGAAGATTCTCTTGAAATCTTCACTTAGCCATTGGtc；
[0159] siRNA序列：CCAATGGCTAAGTGAAGAT
[0160] siRNA 片断 3:
[0161 ] CcggcaGTATAGAGCGTGCAGATAATTCAAGAGATTATCTGCACGCTCTATACtgTTTTTg；
[0162] aattcaaaaacaGTATAGAGCGTGCAGATAATCTCTTGAATTATCTGCACGCTCTATACtg；
[0163] siRNA序列：GTATAGAGCGTGCAGATAA
[0164] siRNA 片断 4:
[0165] CcggaaGTGAAGATGACAATCATGTTTCAAGAGAACATGATTGTCATCTTCACttTTTTTg；
[0166] aattcaaaaaaaGTGAAGATGACAATCATGTTCTCTTGAAACATGATTGTCATCTTCACtt；
[0167] siRNA序列:GTGAAGATGACAATCATGT。
【主权项】
1. 一种PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 利用AgeI和EcoR頂每切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体 质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，再用冷却的无 菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取180_200μ1转移到无菌的微量离心管中，4只离心管分 别加2-4μ1连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟； 52、 将步骤S1中处理后的4只离心管放到预加温到40-45°C的循环水浴中放好的试管架 上，静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却1-2分钟； 53、 向上述4支离心管中分别加800μ1S0C培养基，用水浴将培养基加温至37°C，然后将 离心管转移到37°C摇床上，温育42-46分钟使细菌复苏，再将150μ1已转化的感受态细胞转 移到含20mmo1/LMgS04和Amp抗性的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒 置平皿，于37°C培养，16小时； 54、 将4个siRNA干扰片断连接pGCSIL-GFP质粒的PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别阳性 克隆和阴性克隆，并挑选阳性克隆测序。2. 根据权利要求1所述的PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤S1所 述利用AgeI和EcoRI酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体质粒， 将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，再用冷却的无菌吸头 从每种感受态细胞悬液中各取200μ1转移到无菌的微量离心管中，4只离心管分别加2μ1连 接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。3. 根据权利要求1所述的PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤S2所 述4只离心管放到预加温到42°C的循环水浴中放好的试管架上，静静放置90秒后快速将离 心管转移到冰浴中，冷却2分钟。4. 一种如权利要求1-3任一所述的PTEN基因干扰慢病毒载体，其特征在于，所述载体转 染Hela细胞，利用Real-timePCR，对PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行检 测。5. 根据权利要求4所述的PTEN基因干扰慢病毒载体，其特征在于，所述Hela细胞内PTEN 基因的表达有下调作用。
【专利摘要】本发明提供一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法，涉及基因工程技术领域，制备了PTEN基因干扰慢病毒载体，分别将4个siRNA干扰片断，通过酶切位点与载体连接后，通过PCR产物凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆测序,还与pHelper？1.0、pHelper2.0两种包装质粒共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，再利用Real-time？PCR，对4个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行了检测，结果显示，四个靶点对Hela细胞内PTEN基因的表达都有显著下调作用，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85％，为进一步大量扩增提取病毒奠定了基础。
【IPC分类】C12N15/867, C12N15/66
【公开号】CN105483151
【申请号】CN201510980131
【发明人】关翼
【申请人】吉林大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日