辣椒素类物质通用人工半抗原、人工完全抗原及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及辣椒素类物质通用人工半抗原、人工完全抗原及其应用，属于免疫化 学技术领域。
【背景技术】
[0002] 辣椒素类化合物是存在于辣椒果实中的使其具有辛辣刺激的主要化学物质，主要 包括辣椒素、二氢辣椒素、高二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素等二十多种已知的结构 类似的化合物。其中辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类物质总量的90%，并提供了约90% 的辣热感刺激。随着人民圣湖水平的提高，辣椒素类物质的营养品质和药用价值逐渐被发 现。辣椒素类物质除了被广泛应用于食品工业中，还被用于医药保健、生化材料、生物武器 等领域。在食品加工领域，目前还没有一种简便、有效且准确的方法，来区分食品的辣味程 度分级。合成辣椒素具有与天然辣椒素类物质类似的结构部和功能，且在价格和辣度上比 天然辣椒素类物质更占优势，常被用作辣椒素类物质的替代品。因此，食品中辣椒素类物质 的分析测定对辣椒产品的研发与标准化及其品质评价意义重大。
[0003] 目前，高效液相色谱法、色谱-质谱联用等现代仪器检测方法是辣椒素类物质最常 用的检测方法，其灵敏度高、准确性好，但是仪器设备昂贵，对实验环境要求高，且要求专业 操作人员，难以实现快速检测。近年来迅速发展起来的免疫分析方法由于克服了上述方法 的缺点，并具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉、适于现场批量检测 等优点，被广泛应用于医学、农学等各个领域。
[0004] 免疫分析是基于抗原、抗体的特异性识别反应的一种分析方法，其核心试剂是高 质量的特异性抗体。但是辣椒素类物质的分子量都低于500,属于小分子物质，本身不具有 免疫原性，需要与大分子的载体蛋白进行偶联才能使其具备免疫原性。因此，要获得高质量 的特异性抗体，首先要将辣椒素类物质与载体蛋白结合，获得具有免疫原性的辣椒素类物 质通用人工完全抗原。目前，国内外鲜有针对辣椒素类物质通用人工完全抗原的报道。因 此，研制辣椒素类物质通用人工半抗原、人工完全抗原不仅填补了辣椒素类物质免疫检测 的空白，为辣椒素类物质的快速检测开辟新思路，对实现辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素 总量免疫定量检测具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的发明目的是提供一种新型的辣椒素类物质通用人工半抗原、人工完全抗 原及其应用。
[0006 ]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0007]本发明提供的辣椒素类物质通用人工半抗原化合物，具有式I所示的分子结构：
[0008]
其化学名称为4-[ (4-羟基-3-甲氧基）苄胺基]- 4-幾基駿酉爱（4_[ (4-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-4_oxobutanoic acid) 〇
[0009] 提供辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物，其分子结构式如式Π 所示：
[0010] 按上述方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白 KLH0
[0011] 上述辣椒素类物质通用人工半抗原化合物的合成方法，以香兰素胺盐酸盐与丁二 酸酐为原料，在缚酸剂三乙胺的存在下，经一步酰胺化反应合成人工半抗原化合物，其结构 式即I所示，合成路线如下：
[0013] 按上述方案，所述辣椒素类物质人工半抗原化合物的合成方法，包括以下步骤:将 摩尔比为1: (0.9~1.2)的香兰素胺盐酸盐和三乙胺溶于四氢呋喃中，室温搅拌20-40min， 加入等摩尔量的丁二酸酐后继续室温搅拌反应7小时以上，后处理得到辣椒素类物质通用 人工半抗原化合物I。按上述方案，所述后处理为：加入乙酸乙酯，室温搅拌，过滤后得白色 沉淀即为样品。
[0014] 上述辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法，它是将辣椒素类物质通 用人工半抗原通过N，N'_二环己基碳二亚胺DCC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，再与载体蛋 白进行偶联得到。
[0015] 上述辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法，包括以下具体步骤：
[0016] (1)辣椒素类物质通用人工半抗原活化:将辣椒素类物质通用人工半抗原在N，N_ 二甲基甲酰胺中与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应30min-2h，然后加入二环己基碳二亚 胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应4-6小时，4°C静置过夜，取上清液即活化的辣椒素类 物质人工半抗原溶液，所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-1.2；
[0017] 或将辣椒素类物质人工半抗原溶解在N，N-二甲基甲酰胺中顺序加入三正丁胺和 氯甲酸异丁酯，室温反应〇.5-3h小时，所得反应液即活化的辣椒素类物质人工半抗原溶液， 所述三正丁胺和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1-1.2;
[0018] (2)将上述（1)所得活化的辣椒素类物质通用人工半抗原上清液滴加到载体蛋白 浓度大于等于2mg/mL的载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，室温条件反应4-8h，其中：所述活化的 辣椒素类物质通用人工半抗原与载体蛋白的摩尔比大于10:1，然后透析得到辣椒素类物质 通用人工完全抗原。
[0019] 按上述方案，所述的载体蛋白的磷酸盐缓冲液是将载体蛋白用0.2M PH8.0的磷酸 盐缓冲液溶解得到的。
[0020] 按上述方案，所述的透析为用0.OlM PBS缓冲液透析72h，期间，4-8h更换一次透析 液。
[0021] 上述辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物在制备辣椒素类物质特异性抗体中 的应用。应用方法为:将上述辣椒素类物质通用人工完全抗原免疫日本大耳兔，免疫4-6次 后，兔颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，得 到辣椒素类物质通用抗体，即可与辣椒素类物质发生特异性免疫反应的球蛋白。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[0023] 本发明通过将辣椒素中香草基胺的酚羟基进行修饰，提供的人工半抗原既最大程 度保留了辣椒素类物质的特征结构(辣椒素主要分子结构中的香草基胺和部分脂肪链基 团），可作为抗原决定簇，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。进而可免疫获得亲 和力高，灵敏度高，特异性强的辣椒素抗体。实验结果表明，用本发明提供的抗原免疫动物 得到的抗血清效价可达128000，得到的抗体对辣椒素类物质的半抑制浓度IC 5q值为0.7yg/ mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50%抑制浓度IC5q依次为I. lyg/mL、0.5yg/mL、l .8 yg/mL，表明该抗血清可以特异性与辣椒素类物质反应，并可以作为辣椒素类物质通用抗 体。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法、胶体金试纸快速检测法和时 间分辨荧光试纸条检测法，为食品辣味的标准化管理提供关键技术支撑。
【附图说明】：
[0024] 图1为本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原紫外光谱图。
[0025] 图2本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原紫外光谱图。
【具体实施方式】
[0026] 下述实例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 实施例1辣椒素类物质通用人工半抗原的制备
[0029] 称取香兰素胺盐酸盐0.28g溶于6ml四氢呋喃，搅拌滴加0.15g三乙胺，室温搅拌 3011^11。准确称取丁二酸酐0.158(0.0015111〇1)加入上述反应液中，室温搅拌过夜。向反应液 中加入3mL乙酸乙酯室温搅拌2min，过滤后所得沉淀即为半抗原为4-[(4_羟基-3-甲氧基） 节胺基]_4_幾基駿酸（4_[ (4-hydroxy-3-methoxybenzyl )amino]-4_oxobutanoic acid)， 分子式为C12H15NO5。
[0030]经核磁鉴定结果为=1H NMR(400MHz，DMS0)Sl2.17(s，lH)，8.87(s，lH)，8.31(d，J = 6.0Hz,lH) ,4.21(d,J = 5.8Hz,2H) ,3.80(s,3H) ,2.52(t ,J = 6.9Hz,2H) ,2.42(t,J = 6 . 7 H z，2 H )。与其结果的理论值一致，表明该半抗原化合物成功合成。
[0031 ]实施例2辣椒素类物质通用人工完全抗原-免疫抗原的制备 [0032] 称取上述辣椒素类物质通用人工半抗原20.3mg(约0 · 08mmol)和11 · 6mg(约 0.1mmol)NHS于反应瓶中，加入400ulDMF溶解于反应瓶中，室温搅拌30min，称取20.6mg(约 0.1 mmol )DCC溶于lOOulDMF中，将DCC/DMF溶液逐滴滴加至上述反应瓶，室温搅拌4h，4°C静 置过夜。8000rpm/5min，取上清活泼酯液。
[0033] 将上清活泼酯液，逐滴滴加到6ml 7mg/ml的BSA溶液中反应，反应缓冲液为0.2M PH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室温进行4h。将反应液置透析袋内，用0.0 lM pH7.4的PBS中4°C搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-免 疫抗原。紫外_可见光谱连续扫描图谱见图1，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。
[0034]实施例3辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原的制备 [0035] 称上述辣椒素类物质通用人工半抗原4.55mg溶于200yL无水DMF中，然后按顺序加 入4.27yL三正丁胺、2.34yL氯甲酸异丁酯，室温下搅拌避光反应Ih，得活化的辣椒素类物质 半抗原溶液。
[0036] 将活化的辣椒素类物质半抗原溶液逐滴滴加到IOml 4.5mg/ml的OVA溶液中反