抗体检测。采 用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接 ELI SA法筛选出抗辣椒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔;第二步采用间接竞争ELI SA法对第 一步筛选出的阳性孔进行检测，用辣椒素作为竞争原，与固定在ELISA板上的抗原竞争性的 结合上清中的抗体，其中与辣椒素结合的抗体将会在之后的步骤被洗掉，与包被抗原结合 的抗体则被固定在ELISA板上，加入HRP标记的羊抗鼠抗体及显色液后则会显色。竞争原辣 椒素浓度越高，显色越浅，450nm处的吸光度值越低。选择未加竞争原时吸光值较高和灵敏 度均较高的孔(此处吸光值较高指，竞争原为〇的孔所测得吸光值，灵敏度较高指抑制率为 50 %时的竞争原浓度IC5q值较小）。采用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养，克隆后待细 胞集落长至肉眼可见大小时，分别将每个细胞集落挑至液体培养基中，采用同样的两步筛 选法进行检测，如此重复克隆1次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株YQQD8。该细胞株YQQDSB 于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉 大学，保藏编号为CCTCC N0.C201534,分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。
[0081 ] b抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系YQQD8抗体 可变区序列测定
[0082] (1)提取总RNA:采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交 瘤细胞株系YQQD8的总RNA;
[0083] ( 2 )合成cDNA :以步骤1获得的总RNA为模板，〇 I i go ( dT ) 1 5为引物，按照 SuperScriptTM-2 Π 反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物〇1 igo(dT) 15由 Invitrogen 购得；
[0084] (3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引 物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为:94°C30s、55°C45s、72°C Imin， 扩增30个循环，最后72°C延伸lOmiruPCR产物经过1% (重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离 后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑 取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为:重链可变 区引物为5,-GAV GTG AWG STG GTG GAG TC-3，（20mer)和5,-GAG GAG ACG GTG ACT GAG GT-3，（ 20mer)其中S、R和W为简并碱基，M=A/C，R=A/G，S = C/G，W=A/T，轻链可变区引物为 5，-RTTKTGATGACCCARAC-3，（17mer#P5，-ACGTTTKATTTCCAGCTTGG-3，（20mer) 〇 [0085] 得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长313bp，序列如SEQ ID NO: 1所 示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由104个氨基酸组成，序 列如SEQ ID N0:3所示。轻链可变区编码基因序列长299bp，序列如SEQ ID N0:2所示，根据 所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由99个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。
[0086] c抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴 定
[0087]将实施例2获得的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞 株系YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛 酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4 °C，12 0 0 0 r / m i η离心 15min，吸取上清，将所得腹水上清与3倍体积的醋酸盐缓冲液混合，用2mol/L的盐酸溶液调 节该混合液的PH值至4.7，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33yL， 室温混合30min，4°C静置2h，然后4°C，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双 层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为〇.lmol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用 2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4°C预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终 浓度为〇. 277g/mL，4°C静置2h，然后4°C，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹 水体积1/10的0.0 lmol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对0.0 lmol/L磷酸盐缓冲液透析， 将充分透析好的蛋白溶液置-70°C冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯 化好的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，将抗体置-20°C冰箱中备用;所 述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0. HlmL醋酸加水定容至IOOmL所得;所述的0. lmol/L的 磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加 水定容至IOOmL所得。
[0088]用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株YQQD8分泌的抗辣椒素、二氢辣椒素、合 成辣椒素通用单克隆抗体的亚型为I gGi。
[0089]用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达 2.56 X 106,即鼠腹水抗体稀释2.56 X IO6倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争 ELISA法鉴定其对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50%抑制浓度IC5q依次为8.5ng/mL、 5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9 % -170%〇
【主权项】
1. 辣椒素类物质通用人工半抗原化合物，其特征在于:具有式I所示的分子结构：其化学名称为4-[(4-径基-3-甲氧基）节胺基]-4-幾 基簇酸。2. 辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物，其特征在于:其分子结构式如式Π 所示： 载体蛋白。?3. 根据权利要求2所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物，其特征在于:所述载 体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。4. 权利要求1所述的辣椒素类物质通用人工半抗原化合物的合成方法，其特征在于 香兰素胺盐酸盐与下二酸酢为原料，在缚酸剂Ξ乙胺的存在下，经一步酷胺化反应合成人 工半抗原化合物，合成路线如下：5. 根据权利要求4所述的辣椒素类物质通用人工半抗原化合物的合成方法，其特征在 于:包括W下步骤:将摩尔比为1:(0.9~1.2)的香兰素胺盐酸盐和Ξ乙胺溶于四氨巧喃中， 室溫揽拌20-40min，加入等摩尔量的下二酸酢后继续室溫揽拌反应7小时W上，后处理得到 辣椒素类物质通用人工半抗原化合物I。6. 权利要求2所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法，其特征在于： 它是将辣椒素类物质通用人工半抗原通过N，N'-二环己基碳二亚胺DCC与N-径基班巧酷亚 胺N服活化，再与载体蛋白进行偶联得到。7. 根据权利要求6所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法，其特征 在于:包括W下具体步骤： (1) 辣椒素类物质通用人工半抗原活化:将辣椒素类物质通用人工半抗原在N，N-二甲 基甲酯胺中与N-径基班巧酷亚胺(NHS)室溫反应30min-化，然后加入二环己基碳二亚胺的 N，N-二甲基甲酯胺溶液，室溫反应4-6小时，4°C静置过夜，取上清液即活化的辣椒素类物质 人工半抗原溶液，所述N-径基班巧酷亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-1.2; 或将辣椒素类物质人工半抗原溶解在N，N-二甲基甲酯胺中顺序加入Ξ正下胺和氯甲 酸异下醋，室溫反应0.5-化小时，所得反应液即活化的辣椒素类物质人工半抗原溶液，所述 Ξ正下胺和氯甲酸异下醋的摩尔比为1:1-1.2; (2) 将上述（1)所得活化的辣椒素类物质通用人工半抗原上清液滴加到载体蛋白浓度 大于等于2mg/mL的载体蛋白的憐酸盐缓冲液中，室溫条件反应4-化，其中：所述活化的辣椒 素类物质通用人工半抗原与载体蛋白的摩尔比大于10:1，然后透析得到辣椒素类物质通用 人工完全抗原。8. 根据权利要求6所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法，其特征 在于:所述的载体蛋白的憐酸盐缓冲液是将载体蛋白用0.2M pH 8.0的憐酸盐缓冲液溶解 得到的。9. 权利要求1所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物在制备辣椒素类物质特异 性抗体中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于:应用方法为:将上述辣椒素类物质通用人 工完全抗原免疫日本大耳兔，免疫4-6次后，兔颈动脉采血至其死亡，采到的血液离屯、后，将 抗血清利用辛酸-硫酸锭法进行纯化，得到辣椒素类物质通用抗体，即可与辣椒素类物质发 生特异性免疫反应的球蛋白。
【专利摘要】本发明涉及辣椒素类物质通用人工半抗原、人工完全抗原及其应用。辣椒素类物质通用人工半抗原化合物，具有式Ⅰ所示的分子结构：辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物，其分子结构式如式Ⅱ所示：Pr载体蛋白。本发明的人工完全抗原可免疫获得亲和力高，灵敏度高，特异性强的辣椒素抗体。CCTCC NO: C20153420150423
【IPC分类】C07C233/22, C07K16/06, C07K14/77, C07K16/44, C07K14/765, C07C231/02, C07K14/795
【公开号】CN105541655
【申请号】CN201610079136
【发明人】李培武, 杨青青, 张奇, 马飞, 张良晓, 张文, 唐晓倩, 丁晓霞
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月4日