含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10，〇〇〇个细胞接 种到12孔板，每孔体积为I ml; ② 培养细胞:5% C02,37°C孵育24 h，至细胞单层铺满孔底； ③ 药物处理:加入制备出的BSNQ(IC5t): 1.40 μΜ)，处理不同时间（0,3,6，12,24 h); ④ 用PBS洗涤2次，加入 195 μL Annexin V-FITC结合液，再加入5 μL Annexin V-FITC 轻轻混匀； ⑤ 加入10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，轻轻混勾； ⑥ 室温(20-25°C)避光孵育15分钟； ⑦ (A)在荧光显微镜下观察细胞的形态及颜色的改变，绿色荧光为Annexin V-FITC染 色阳性细胞，红色荧光为碘化丙啶阳性细胞。仅被绿色荧光染色，且体积较小的细胞为凋亡 细胞;被红色或绿色和红色双染，且体积较大的细胞为坏死细胞;未被染色的细胞为正常细 胞。随机观察200个细胞，求得各种细胞所占的百分比，每个样本计数3次取平均。（B)同时， 也利用流式细胞术方法检测BSNQ对人肝癌细胞的凋亡。
[0023] 1、用BSNQ处理Hep3B细胞，检测BSNQ对人肝癌Hep3B细胞的凋亡 采用上述实验方法，得到的实验结果见图4A、图4B、图5A及图5B，其中图4A是用BSNQ处 理Hep3B细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图，shikonin和5-FU为阳性对照组；图 4B是图4A的定量分析图。图5A是用BSNQ和OSNQ处理Hep3B细胞后，利用流式细胞术检测细 胞凋亡情况图；图5B是图5A的定量分析图。
[0024]结果分析 用BSNQ(终浓度为1.40 μΜ)处理人肝癌Hep3B细胞0、3、6、12、24 11后，进行4111161丨11￥-FITC/PI双染实验，并在荧光显微镜观察。从图4B中可以看出，随着药物处理时间的不断增 加 ，Annexin V-FITC荧光强度也逐渐增强，其细胞凋亡程度也显著增加。尤其当时间为24 h 时，细胞的荧光强度最高。结果说明，BSNQ可以有效诱导Hep3B细胞的凋亡，并呈时间依赖 性。
[0025]用BSNQ(终浓度为1.40 μΜ)处理人肝癌Hep3B细胞0、3、6、12、24 11后，进行4111^^111 V-FITC和PI进行标记，通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。从图5B中可以看出，随着药物处 理时间的不断增加，肝癌Hep3B细胞凋亡的程度也随之增加，尤其当药物处理时间达到24 h 时，细胞的凋亡水平明显增加。这一结果说明，BSNQ可以有效诱导Hep3B的凋亡，并呈时间依 赖性。
[0026] 2、用BSNQ处理HepG2细胞，检测BSNQ对人肝癌HepG2细胞的凋亡 采用上述实验方法，得到的实验结果见图6A及图6B，其中图6A是用BSNQ处理HepG2细 胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图，hikonin和5-FU为阳性对照组；图6B是6A图的 定量分析图。
[0027]结果分析 用BSNQ(终浓度为1.40 μΜ)处理人肝癌HepG2细胞0、3、6、12、24 11后，进行4111161丨11￥-FITC/PI双染实验，并在荧光显微镜观察。从图6B中可以看出，随着药物处理时间的不断增 加 ，Annexin V-FITC荧光强度也逐渐增强，其细胞凋亡程度也显著增加。尤其当时间为24 h 时，细胞的荧光强度最高。BSNQ可以有效诱导!fepG2细胞的凋亡，并呈时间依赖性。
[0028] 3、用BSNQ处理Huh7细胞，检测BSNQ对人肝癌Huh7细胞的凋亡 采用上述实验方法，得到的实验结果见图7A及图7B，其中图7A是用BSNQ处理Huh7细胞 后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图，shikonin和5-FU为阳性对照组；图7B是图7A的定 量分析图。
[0029]结果分析 用83购(终浓度为1.40以1〇处理人肝癌肋117细胞0、3、6、12、24 11后，进行4111161丨11￥-FITC/PI双染实验，并在荧光显微镜观察。从图7B中可以看出，随着药物处理时间的不断增 加 ，Annexin V-FITC荧光强度也逐渐增强，其细胞凋亡程度也显著增加。尤其当时间为24 h 时，细胞的荧光强度最高。BSNQ和OSNQ可以有效诱导Huh7细胞的凋亡，并呈时间依赖性。 [0030] 综上所述，BSNQ(IC5t): 1.40 μΜ)可以诱导人肝癌Hep3B、!fepG2和Huh7细胞的凋亡， 其癌细胞凋亡能力随着时间的增加而逐渐升高。
【主权项】
1. 一种2-丁亚砜-1，4-萘醌的制备方法，具体按照以下步骤进行： (1) 2-丁巯基-1，4-萘醌的合成 在反应容器中加入1，4_萘醌和甲醇，甲醇的量满足充分溶解1，4_萘醌即可，二者混合 均匀后加入1-丁硫醇，1-丁硫醇与1，4_萘醌的摩尔比为1.5:1，室温下反应3-5小时后，向反 应容器中加入重铬酸钠和浓硫酸，重铬酸钠与1，4-萘醌的摩尔比为1:5,浓硫酸与1，4-萘醌 的摩尔比为3:4，继续反应5-10分钟;然后用二氯甲烧和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥， 过滤，浓缩至干燥，得2-丁巯基-1，4-萘醌； (2) 2-丁亚砜-1，4-萘醌的合成 在反应瓶中，加入步骤（1)产物2-丁巯基-1，4-萘醌和氯仿，氯仿的量满足充分溶解2-丁巯基-1，4-萘醌即可，继续加入3-氯过氧苯甲酸，3-氯过氧苯甲酸与2-丁巯基-1，4-萘醌 的摩尔比为1.2:1，0°C温度下反应1.5-2.5小时，反应完全后加入5% NaHC03溶液中和反应 中过剩的3-氯过氧苯甲酸后终止反应;反应产物经二氯甲烷和饱和食盐水萃取，无水硫酸 钠干燥，过滤，浓缩至干燥，得2-丁亚砜-1，4-萘醌。
【专利摘要】本发明公开了一种2-丁亚砜-1,4-萘醌的制备方法，解决了现有仅从植物中提取和分离萘醌类化合物远远不能满足研究和应用需求的问题。具体分两步进行，首先合成2-丁巯基-1,4-萘醌，使1-丁硫醇与1,4-萘醌室温下反应3-5小时后，加入重铬酸钠和浓硫酸，继续反应5-10分钟后对产物进行后处理得2-丁巯基-1,4-萘醌；然后合成2-丁亚砜-1,4-萘醌，将2-丁巯基-1,4-萘醌与3-氯过氧苯甲酸在0℃温度下反应1.5-2.5小时，反应产物经后处理得2-丁亚砜-1,4-萘醌。本发明制备方法的合成路线简单，反应温度低，得到的2-丁亚砜-1,4-萘醌产物，抗癌效果明显，而且对癌细胞的选择性高。
【IPC分类】C07C315/02, C07C317/12
【公开号】CN105541678
【申请号】CN201610046372
【发明人】金成浩, 孙虎男, 罗英花, 臧延青, 申贵男, 刘畅, 吴丹丹, 蒋雪园, 孟令旗, 王浩, 徐婉婷
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月25日