Tp重组抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测领域，特别是涉及一种TP重组抗原及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 梅毒是一种性传播疾病，其病原体是梅毒螺旋体，也叫苍白螺旋体（Treponema pallidum，TP)，主要通过性接触和血液传播，并产生多种多样的症状和体征，且时隐时显， 病程可持续很长，几乎可侵犯全身各器官。是仅次于艾滋病的严重危害我国人民身体健康 的性传播疾病，近年来在我国有上升的趋势，据2014年梅毒重点疫情报告，2009年以来梅毒 位于乙类传染病报告发病数的第三位;尤其是在产前门诊筛查出的梅毒抗体阳性的孕妇显 著增加，给我国的公共卫生带来新的问题。
[0003] 国内外对梅毒的发病机制和诊断方式进行了大量的研究，梅毒的诊断和治疗后效 果评价一直是利用体液免疫学指标，目前国内对血源筛选还有部分采用RPR和TRUST方法， 其主要缺点是敏感性和特异性不高，许多非梅毒性疾病，包括类风湿性关节炎、系统性红斑 狼疮、慢性迀延性肝炎等均可呈阳性反应。而荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验和梅毒螺旋体 血凝试验虽大大改善了检测的特异性，但是需制备大量病原体，且质量难以控制，也不利于 大规模的血液筛查工作。因此，研制快速、简便、灵敏且特异的诊断试剂是当前的主要任务。 [0004]目前应用比较广泛的梅毒螺旋体血清检测方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶 体金或乳胶快速检测。此方法以抗原-抗体的特异性识别为基础。酶联免疫吸附试验 (ELISA)具有灵敏度高、特异性好的优势，已经成为梅毒检测的主流方法。而胶体金或乳胶 法具有快捷、方便的优势，已经应用得越来越广泛。
[0005] 免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理如下： 利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸条的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗 体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结 合形成复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被的抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的 检测线(T线），通过检测线的有无实现对结果的判定。
[0006] 从方法学上讲，目前梅毒ELISA和胶体金检测用的都是标记物和标记抗原直接标 记的双抗原夹心法，其存在的固有缺陷如下：
[0007] 1、当标记物为酶、发光物质、放射性物质等小标记物时，为了提高灵敏度，需要提 高标记比例，但是比例过高会使标记抗原被标记物所包裹，使得抗原表位被包埋而导致抗 原活性降低；
[0008] 2、当标记物为较大的纳米颗粒如使用胶体金、乳胶或其他纳米颗粒类标记物时， 理论上最佳的灵敏度状态是标记比例越低灵敏度越高，摩尔比为1:1时灵敏度最高，但由于 直接标记过程中，标记抗原用量过低会导致标记沉淀等不易标记因素而使标记比例无法降 得过低，从而导致灵敏度偏低，同时标记抗原使用量的提高也会导致特异性降低。因此，急 需在现有梅毒双抗原夹心法试剂盒的上面做出进一步的改进，提高试剂盒的灵敏度的同时 改善特异性。
[0009] 80年代初，随着分子生物学技术的发展，特别是基因工程(DNA重组)技术的出现使 梅毒螺旋体的研究进入一个新的阶段，梅毒螺旋体的全部基因组DNA序列己经被解析。通过 重组梅毒螺旋体DNA的克隆以及在大肠杆菌中的表达，制备出多种重组TP抗原，为梅毒的研 究提供了一条新的途径。但原核表达缺乏翻译后修饰功能，有时需要特殊蛋白伴侣一起表 达并进一步的进行复性处理或保存缓冲液的摸索才能使其蛋白活性较好的表现出来。
【发明内容】
[0010]基于此，有必要提供一种蛋白活性较好的TP重组抗原及其制备方法和应用。
[0011] -种TP重组抗原，包括依次连接的嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链 接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽。
[0012] 在一个实施例中，还包括GST标签，所述GST标签、所述嵌合表达多肽以及所述柔性 链接肽依次连接。
[0013] 在一个实施例中，所述TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原为(a)、由SEQ ID No.l所 示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；（b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列 组成的多核苷酸具有至少98 %同源性的多核苷酸编码得到的多肽;或（c)、由SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核 苷酸编码得到的多肽。
[0014] 在一个实施例中，所述柔性链接肽为(a)、由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成 的多核苷酸编码得到的多肽；（b)、与SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有 至少98%同源性的多核苷酸编码得到的多肽;或（c)、由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组 成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
[0015] 一种上述的TP重组抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0016] 步骤一、提供基因表达载体，所述基因表达载体用于表达TP重组抗原，所述TP重组 抗原包括嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽；
[0017] 步骤二、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞；
[0018] 步骤三、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表 达液；
[0019] 步骤四、对所述表达液中进行饱和硫酸铵梯度分析，确定沉杂蛋白和沉目的蛋白 的硫酸铵浓度，加入相应的沉杂的硫酸铵终浓度，充分静止后收集上清，接着在所述上清中 加入饱和硫酸铵沉目的蛋白的终浓度，充分静止后收集沉淀，将所述沉淀重新溶解，得到粗 产物；以及
[0020] 步骤五、利用亲和柱纯化所述粗产物，再进行亲和柱及离子交换纯化，得到所述TP 重组抗原。
[0021] -种梅毒检测试剂，所述梅毒检测试剂含有上述的TP重组抗原的溶液；
[0022]所述TP重组抗原的溶液中含有质量百分浓度为0.1 %~0.3 %的吐温20或质量百 分浓度为0.1 %~0.3%的Triton X-IOOo
[0023] -种梅毒检测试纸，包括包被抗原、标记抗原、GST单克隆抗体及标记物；
[0024] 所述标记抗原包括依次连接的GST标签、嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的 柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽；
[0025] 所述包被抗原包括依次连接的所述嵌合表达多肽以及所述柔性链接肽；
[0026] 所述标记物通过所述抗GST单克隆抗体与所述标记抗原间接结合。
[0027] 在一个实施例中，所述TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原为(a)、由SEQ ID No.l所 示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；（b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列 组成的多核苷酸具有至少98 %同源性的多核苷酸编码得到的多肽;或（c)、由SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核 苷酸编码得到的多肽；
[0028]所述柔性链接肽为(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得 到的多肽；（b)、与SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的 多核苷酸编码得到的多肽;或(c )、由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中 一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
[0029] -种梅毒检测试剂盒，包括上述的梅毒检测试剂，或者包括上述的梅毒检测试纸。
[0030] 上述的TP重组抗原，在制备梅毒检测试剂领域或制备梅毒检测设备领域的应用。
[0031] 这种TP重组抗原通过引入有助于可溶性表达的柔性链接肽对TPN15-TPN17-TPN47 嵌合表达多肽进行修饰，相对于传统的TP抗原，这种TP重组抗原的蛋白活性较好。
【附图说明】
[0032] 图1为一实施方式的TP重组抗原的制备方法的流程图；
[0033] 图2为一实施方式的梅毒检测试纸的正面示意图；
[0034] 图3为如图2所示的梅毒检测试纸的截面示意图；
[0035] 图4为一实施方式的梅毒检测试剂盒的结构示意图；
[0036] 图5为实施例1中包被抗原和标记抗原的SDS-PAGE胶纯度电泳图。
【具体实施方式】
[0037]下面主要结合附图及具体实施例对TP重组抗原及其制备方法和应用做进一步的 解释说明。
[0038] 一实施方式的TP(苍白螺旋体)重组抗原，包括嵌合表达多肽以及有助于可溶性表 达的柔性链接肽，嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽。
[0039]这种TP重组抗原可以用作包被抗原和标记抗原，应用到梅毒检测领域。
[0040]作为标记抗原时，这种TP重组抗原还包括GST标签，GST标签、嵌合表达多肽以及柔 性链接肽依次连接。
[0041 ] 具体的，TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原为：（a)、由SEQ ID No.l所示的核苷酸 序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；（b)、与SEQ ID No.l所示的核苷酸序列