1-磺酰胺基-4-芳氧基类化合物、制备方法及其医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类具有抗炎活性以1-磺酰胺基-4-芳氧基 类为基本骨架的化合物，包括这些化合物制备方法以及在抗炎领域的应用。
【背景技术】
[0002] 目前普遍使用的抗炎治疗药物主要分为留体类抗炎药，主要是皮质激素类和非甾 体抗炎药主要是环加氧酶抑制剂。非留体抗炎药的化学结构虽然各不相同，但大多通过抑 制前列腺素的合成，发挥其解热、镇痛、消炎作用。目前临床使用的这些抗炎药物均是通过 抑制炎症反应而产生抗炎药效，并不能或是很少能改善形成炎症的病因。要从根本上是治 疗炎症需要改善形成炎症的微环境并激活体内的抗炎系统。炎症反应和氧化应激具有重要 的内在关联性。氧化应激可以导致蛋白、核酸和脂类分子损伤，从而引起炎性损伤，激活炎 症因子、诱发和加剧炎症反应，这种炎症与肿瘤，心血管疾病、帕金森、阿尔兹海默症、慢性 肾病等疾病的发生和发展密切相关;而抗氧应激相关的蛋白可以清除活性氧、加速异物代 谢并升高体内抗氧化蛋白含量从而改善炎性微环境而治疗炎症（Trends Biochem Sci 2009；34(4):176-188；Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007；47:89-116；J Biochem Mol Biol 2004;37(2):139-143;Genes Cells 2011;16(2):123-140)〇
[0003] Nrf2是1994年首次在血红素诱导的红系K562细胞中被鉴定出来，参与调控氧化应 激的关键转录因子。Nrf2属于亮氨酸拉链核转录因子家族，和果绳CNC(Cap n'Collar)家族 同源，人类Nrf2和核因子红系2亚单位p45高度同源。氧化应激相关的大部分抗氧化基因都 包括抗氧化反应元件(ARE)，Nrf2通过结合ARE而发挥转录起始活性。ARE的共同序列为5'-RTGAYnnnGCR-3'（其中R = A or G，Y = C or ThKeapl是细胞内Nrf2的主要负调控蛋白，其 主要功能是在正常情况下保持细胞内较低的Nrf2水平;在应激状态下解除对Nrf2的负调控 作用，升高Nrf 2的水平。通过抑制Keap 1对Nrf 2的负调控作用可有效升高Nrf 2水平，激活体 内抗氧化系统，减轻炎性损伤，改善炎症微环境，从而达到从根本上缓解和治疗炎症的作 用。
[0004] 目前，Nrf2激活剂已经被用于治疗炎性相关疾病。如富马酸二甲酯已经被FDA批准 用于治疗多发性硬化症，CDDO-Me正在开展治疗肺动脉高压(PAH)的二期临床。另外一些具 有抗炎活性的天然产物和类天然产物也已经被证实可激活Nrf2。例如姜黄素、白藜芦醇和 查尔酮等。
[0005] 这些Nrf2激活剂多具有能和Keapl巯基结合的多不饱和结构，被认为是共价修饰 型的Nrf2激活剂。而最近已有文献报道，竞争性干扰Keapl-Nrf2相互作用亦可有效解除 Keapl对Nrf2的负调控作用而激活Nrf2。此种激活Nrf2的方式具有竞争性、特异性、可逆性 和高选择性的特点，避免了共价修饰激活Nrf 2的潜在毒性问题，是当前研究Nrf 2激活型炎 性疾病治疗药物的热点。
【发明内容】
[0006] 本发明公开一种含醚键和单磺酰胺结构的化合物，其制备方法及其医疗用途。初 步的活性测试证明本发明化合物具有良好的干扰Keapl-Nrf 2的结合，从而激活Nrf 2，具有 潜在的抗炎活性，可以用于治疗众多炎症相关疾病包括慢性阻塞性肺疾病(C0PD)阿尔茨海 默症、帕金森、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病(CKD)、糖尿病、肠部炎症、类风湿性关节炎等。
[0007] 本发明的化合物结构式（I)如下：
[0008]
[0009] 其中Ri代表4-三氟甲基、4-三氟甲氧基、4-硝基、4-羟基、4-羟甲基、4-氰基或4-氨 基;单、双或三取代H、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷氨基或C1-C3酰氨基；
[0010] R2代表4-三氟甲基、4-三氟甲氧基、4-硝基、4-羟基、4-羟甲基、4-氰基、4-氨基、4-吗啉甲氧基、4-苄基甲氧基或4-苄基乙氧基;单、双或三取代H、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧 基、C1-C3烷氨基或C1-C3酰氨基；
[0011] R3 代表 H、-CH2C00H、
[0012] n = 0-3〇
[0013] 心优选代表4-甲氧基、4-溴、4-氯、4-氟、2，4，6-三甲基、4-叔丁基、2，4，6-三甲氧 基、4-甲基、3,4_二甲氧基、4-乙酰氨基或4-三氟甲基。
[0014] 办优选代表4-甲氧基、4-乙氧基、4-异丙氧基、4-氟、4-氯、4-溴、4-乙酰胺基、4-三 氟甲基、4-羟基、4-吗啉甲氧基、4-吗啉乙氧基、4-氨基或4-苄胺基。
[0015] R3 优选代表-CH2C00H 或
[0016] η优选代表0或1。
[0017] 其中药学上可接受的盐是优选通式(I)化合物的羧酸钠盐、羧酸钾盐或羧酸钙盐。
[0018] 本发明还公开了通式（I)化合物的制备方法，当R3为CH2⑶0Η、Η、4_η时，优选 的制备方法如下：
[0019]
[0020] 其中Ri、R2、n的定义同前。
[0021] 化合物（1)到化合物(2)的合成步骤中，采用氢气钯碳还原，所采用的溶剂优选甲 醇和四氢呋喃，钯碳投料量优选化合物(2)到化合物(3)的合成步骤中，化合物(2) 与反应物(Boc) 20物质的量比优选1:1.5~1: 2。
[0022]化合物（3)到化合物(4)的合成步骤中，所采用的碱优选碳酸氢钾、碳酸钾、碳酸 铯、碳酸钠、碳酸氢钠，溶剂优选二甲亚砜，N，N-二甲基甲酰胺、1，4_二氧六环、乙腈中的一 种或几种。
[0023]化合物(4)到化合物（5)的合成步骤中，溶剂体系优选HC1 /CH2C12溶液、CF3C00H/ CH2Cl2〇
[0024] 化合物（5)到化合物(6)的合成步骤中，所采用的碱优选碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸 钠、碳酸氢钠、吡啶、三乙胺，优选在以下溶剂中进行反应:四氢呋喃、二氯甲烷、1，4_二氧六 环。
[0025] 化合物(6)到化合物(7)，化合物(6)与溴乙酸甲酯的重量比优选1:2~1:3，所采用 的碱优选碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠、吡啶、三乙胺，优选在以下溶剂中进行反应： 二甲亚砜，N，N-二甲基甲酰胺、1，4_二氧六环、乙腈。反应温度在室温即可。
[0026] 化合物（7)到化合物（8)，氢氧化锂投料量优选，使氢氧化锂在溶液中浓度为1-3mol/L，其溶剂体系为甲醇/水体系或乙醇/水体系，反应室温即可。
[0027] 化合物（6)到化合物（9)氢氧化锂投料量优选，使氢氧化锂在溶液中浓度为1-3mol/L，其溶剂体系为甲醇/水体系或乙醇/水体系，反应室温即可。
[0028] 化合物（7)到化合物（10)，氢氧化锂投料量优选，使氢氧化锂在溶液中浓度为1-3mol/L，其溶剂体系为甲醇/水体系或乙醇/水体系，反应室温即可。 rV
[0029] 当R3为时，制备方法优选如下： I N hn、m
[0030]
[0031] 其中Ri、R2、n的定义同前。
[0032] 化合物1至化合物6的合成方法与当通式（I)中R3为CH2C00H、H时相同。
[0033]化合物6至化合物11，所采用的碱优选碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠，优选 在以下溶剂中进行反应:二甲亚砜，N，N_二甲基甲酰胺、1，4_二氧六环、乙腈，原料6与溴乙 腈的投料比（物质的量比）为1:1-1:4,反应温度在室温即可。
[0034]化合物11至化合物12，氯化铵投料量(物质的量比）1:4-1:8，，优选在一下溶剂中 进行反应:N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环，一种或几种，加热至回流反应。
[0035]化合物12至目标化合物（13)，氢氧化锂投料量优选，使氢氧化锂在溶液中浓度为 l-3mol/L，其溶剂体系为甲醇/水体系或乙醇/水体系，反应室温即可。
[0036]优选下列化合物：
LUUJV」 卜囬约埋头验甲涉及的化甘物代亏等冋t此处代亏所对吆的化甘物。
[0040]本发明基于Nrf2-Keapl蛋白-蛋白相互作用，发现了结构新颖、具有较好的理化性 质的活性小分子，该小分子在基于荧光偏振的Keapl-Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制实验中， 表现出的活性明显优于公认的阳性对照，一段具有9个氨基酸的Nrf 2(Ac-LDEETGEFL-OH)多 肽。在荧光素酶报告基因试验中，该小分子表现出优于阳性对照tBHQ(特丁基对苯二酚）的 诱导活性，有望进一步开发为抗炎药物。
[0041]下面是本发明的部分代表化合物的药理试验及结果：
[0042] 1.基于荧光偏振的Keapl_Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制实验(FP实验）
[0043] FP实验所使用的仪器是SpectraMax Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices)，根据相应荧光基团选择仪器的激发光和发射光的波长。使用Corning 3676 384 孔板进行实验工作。孔板的反应体系为40yL。其中包含10yL的4nM FITC-9mer Nrf2多肽荧 光探针，10yL的12nM Keap 1 Ke 1 ch结构域蛋白溶液和20yL相应浓度的抑制剂。阳性对照采 用20yL 100nM CPUY192002+10yL探针+10yL蛋白溶液，阴性对照为10yL探针+10yL蛋白溶液 +20yL HEPES缓冲液，空白对照为10yL探针+30yL HEPES缓冲液。在测试前预先在室温下混 匀、孵育30分钟。本实验中探针荧光基团为荧光素，其激发光波长为485nm，发射光波长为 535nm。本研究中使用水平方向和垂直方向的荧光强度(F| |和Fi)计算毫偏值(mP)反应偏 振光的变化情况。
[0044] 抑制剂在某浓度下的抑制率计算方法为
[0045] 抑制率％ = (1-(Ρ--ΡΜη)/(Ρ·χ-ΡΜη)) X 100。
[0046] 该方程中的Pmax、Pmin和P-分别代表Keapl和荧光探针孔的偏振值、荧光探针孔的 偏振值以及含有抑制剂孔的偏振值。使用抑制剂的浓度-抑制率曲线计算化合物的I C5〇.
[0047]
[0048]
[0049] 从上表可以看出，化合物1-14，15，16表现出优于阳性对照，一段含有9个氨基酸的 Nrf2多肽。
[0050] 2、ARE荧光素酶报告基因实验
[0051] 体外细胞培养
[0052]将转染含有ARE荧光素酶报告基因质粒的HepG2细胞（使用自QIAGEN购买的 Antioxidant Response Reporter质粒，根据所给指南进行转染得到）用含有10%胎牛血清 的RPMI-1640培养基，于37°C、5 % C02条件下培养。
[0053] (1)将处于对数生长期的!1叩6241^-08细胞用0.25%胰酶消化液处理，制成浓度 为4X105的细胞悬液。分别向96孔酶标板中加入100yL培养过夜。
[0054] (2)将待测化合物用培养基配置成2倍于所需浓度，分别向对应的孔中加入100yL， 其tBHQ为阳性对照，DMSO为阴性对照。将加好化合物的96孔酶标板至于37 °C、5 %⑶2恒温、 饱和湿度的条件下孵育12h。
[0055] (3)将荧光素酶检测试剂盒中的5X裂解液配置成IX裂解液，备用。
[0056] (4)取出96孔酶标板，将培养基从孔中吸出，用IX PBS缓冲液洗涤细胞，洗涤结束 后将roS缓冲液吸出。每孔加入25或30yL的IX细胞裂解液，冰上裂解15min。裂解完毕，静置 3-5min，吸取20yL的上清裂解液加入对应的96孔白色酶标板中。
[0057] (5)将白色酶标板放入Thermo Scientific Luminoskan Ascent化学发光微孔读 数仪中，测试前向每孔加入lOOyL荧光素酶检测试剂(将荧光素酶检测试剂盒中1瓶荧光素 酶检测底物与1瓶荧光素酶检测缓冲液均匀混合制得），加入检测试剂后lmin之内进行读 数。
[0058]
[0059]
[0060]由上表看，大部分化合物其在低浓度下不能明显的激活ARE，但在FP试验中，IC50 最优的化合物1-14,1-15在10μΜ浓度下，能够在有效激活ARE，且其诱导倍数明显优于阳性 药tBHQ。此外本专利小分子结构较为新颖，具有较好的透膜性1^叩？1-14(4.28±0.45)，1-15(4.81 ±0.45，）有望利用其LogP通过血脑屏障，开发为针对脑部的抗炎药物。
【具体实施方式】 [0061 ] 实施例1
[0062] 2-(4-(N_(羧甲基)-4_甲氧基苯磺酰氨基））萘-1-氧基)苯乙酸
[0063] (1 )4_羟基萘-1-氨基甲酸叔丁酯（1-1)
[0064] 将 1-羟基-4-硝基萘（2 · 8g，14 · 8mmol)溶于30ml CH30H中，加入5% 钯碳（157mg， 1.48mmol)，上接氢气球，于室温下反应。点板检测反应完全，抽滤除去钯碳，向滤液中加入 (Boc) 20(5. lml，22.2mmol)，三乙胺(4. lml，29.6mmol)于是室温下N2保护反应5h.点板显示 反应完全，旋去大部分甲醇，，加水，EA 20ml X 3提取，合并有机层，用饱和NaCl溶液10ml X 3 洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，用二氯甲烷打浆得灰色固体2.5g，产率65.1%。111.?.178.9- 1H,J = 7.95Hz,Ar-H)7.42-7.52(m,2H,Ar-H),7.84(d,lH,J = 7.92Hz,Ar-H) ,8.12(d,lH,J =7.83Hz,Ar-H),8.83(s,lH,-NH-),10.07(s,lH,-OH)；EI-MS m/z:260[M+H]+
[0065] (2)2-((4-叔丁氧羰基氨基)萘-1-氧基)_苯乙酸甲酯（1-2)
[0066] 将 1-1 (2.5g，9 · 6mmol)溶于 10ml DMF中，加入碳酸钾（2.7g, 19 · 3mmol)，最后加入 溴苯乙酸甲酯（1.8ml，11.6mmol)于室温下搅拌。点板反应完全，向溶液中加入水，用饱和 NH4C1溶液调节pH至7，用EA 20ml X 3提取，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤三次，直接制沙， 用PE: EA= 10 :1过柱，分离得灰色产品1 · 34g产率为34 · 1 % a · p · 198 · 8-200 · 5 °C · 匪R (300MHz, DMS0)51.46(s,9H,-Boc),3.66(s,3H,-0CH3),6.24(s,1H,-0CH-),6.90(d,lH,J = 8.34Hz,Ar-H),7.31(d,lH ,J = 8.16Hz,Ar-H),7.40-7.46(m,3H,Ar-H),7.56-7.58(m,2H, Ar-H),7.66-7.68(m,2H,Ar-H),7.91-7.94(m,lH,Ar-H),8.29-8.32(m,1H,Ar-H)9.00(s, 1H,-NH)；EI-MS m/z:430[M+Na]+
[0067] (3)2-((4-(4-甲氧基苯磺酰氨基)萘-1-氧基)_苯乙酸甲酯（1-3)
[0068] 将1-2(500.011^，1.2臟〇1)溶于10.01111〇12(：12中，加入〇卩3〇)0!1(5.01111，67.3111111〇1)， 于室温下搅拌。点板反应完全(约0.5h)，用饱和Na 2C03溶液调节pH至7，用EA 20ml X 3提取， 合并有机层，用饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋干后得的灰色固体5，不经处理， 直接溶于· THF中，加入对甲氧基苯磺酰氯（322 · Omg，1 · 5mmol)，最后加入吡啶（197 · 7yL， 2.5mmol)于室温下搅拌。点板显示反应完全(约8h)，旋干THF，加入少量丙酮使油状物溶解， 加入稀盐酸溶液至出现浑浊，EA 20ml X 3提取，合并有机层，直接旋干制沙，用PE: EA = 8:1 过硅胶柱，分离得淡紫色固体185 . Omg，产率为34.4%，m. p. 223-225°C，匪R( 300MHz， DMS0)53.64(s,3H,-C00CH3),3.76(s,3H,~0CH3),6.20(s,lH,-〇CH~),6.81(d,1H,J= 8.43Hz,Ar-H),6.91-6.99(m,3H,Ar-H),7.39-7.55(m,7H,Ar-H),7.61-7.64(m,2H,Ar-H), 7.91-7.94(m,lH,Ar-H),8.21-8.24(m,lH,Ar-H),9.84(s,lH,-NH)；EI-MS m/z:500[M+Na]+
[0069] (4)2-(4-(4-甲氧基-N-(甲氧羰基甲基)苯磺酰氨基)萘-1-氧基)-苯乙酸甲酯（1-4)
[0070] 将化合物（1-3) (185 · Omg , 387 · Ομπιο?)溶于5ml DMF中，加入碳酸钾（107 · Omg, 775 · Ομπιο 1)，最后加入溴乙酸甲酯（54yL，58Ιμπιο 1)于室温下搅拌。点板反应完全(约2h),向 溶液中加入水，至溶液变浑浊，用饱和NH4C1溶液调节pH至7，有紫色固体析出，抽滤烘干的 紫色固体 138.Omg,产率为64.8%，m.p.l34-136°C，lH-NMR(300MHz，DMS0)S3