一种多重核酸层析快速检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测技术领域，具体地，本发明涉及一种多重核酸层析快速检测 方法及应用。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学、基因组学的不断发展和完善，核酸扩增技术已逐步应用于很多 病原体的检测。LAMP技术:环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP)技术，由Notomi等人于2000年建立，其原理是利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶 和针对靶基因的6个不同区域设计的4条特异性引物，在60~65°C的恒温条件下对靶基因进 行扩增。整个检测反应仅需60分钟，在存在环引物的情况下，扩增时间可进一步缩短为40分 钟。其反应敏感性和特异性比PCR方法高，且因扩增全过程在同一温度下进行，所需仪器设 备低廉，易于携带，适于在基层和现场工作中使用，该技术现已成为生命科学领域研究的热 点之一〇
[0003] 因 LAMP反应体系较为复杂，扩增产物为一系列大小不一的茎环结构和多环花椰菜 结构的DNA片段混合物，无法通过直接比对电泳条带的分子量来区分产物。目前LAMP产物的 检测采用肉眼观察及浊度法检测焦磷酸镁白色沉淀，或者在反应体系中加入镁离子指示剂 羟基萘酚蓝或在终产物中加入荧光染料，通过观察反应前后的颜色变化判定结果，荧光法 检测时不仅荧光试剂对人体会造成伤害，同时也会导致假阳性问题的出现，从而限制了 LMAP技术的推广使用，多重LAMP方法更是鲜有报道。
【发明内容】
[0004] 为了克服以上现有技术中存在的问题，本发明提供一种多重核酸层析快速检测方 法及应用，将RT-LAMP技术、核酸探针杂交技术和胶体金层析技术进行结合，建立了基于胶 体金-LAMP技术的HIV/AIDS和HCV多重核酸快速检测方法，实现多重LAMP产物的快速检测。 本发明包括HIV和HCV RT-LAMP检测体系的建立和胶体金核酸层析法检测多重LAMP反应产 物两个部分。胶体金检测试纸由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫组成，所述 样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫由底板的一侧依次粘贴。根据测试线和质 控线的显色情况进行结果判定，若质控线和测试线均显色，为阳性结果;若质控线显色而测 试线不显色，为阴性结果;若质控线不显色，为试纸条失效。本研究将核酸探针杂交技术与 胶体金层析法结合，通过胶体金核酸层析法对多重LAMP反应产物进行检测，检测过程不需 要昂贵的专业仪器设备，降低了检测成本，提供了检测效率，适用基层医疗卫生单位和大规 模人群HI V和HCV的早期筛查。
[0005] -种多重核酸层析快速检测方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤1)根据待测核酸样品，设计引物并进行合成，中和探针、膜固定探针的制备， 膜固定探针5 '端标记生物素，流动相探针3 '端标记巯基;利用LAMP专用在线引物设计软件 Primer Explorer V4分别设计待测核酸样品引物并进行合成，中和探针、膜固定探针的制 备，膜固定探针5 '端标记生物素，流动相探针3 '端标记巯基；
[0007] 步骤2)制备胶体金核酸层析试纸条:将功能化胶体金溶液均匀浸湿金标结合垫， 膜固定探针与链霉亲和素混匀，室温阴干，将质控探针中的膜固定探针和检测探针中的膜 固定探针分别点样于质控线处和测试线处；
[0008] 步骤3)将步骤1)设计好的引物加入LAMP反应体系中对待测核酸样品进行恒温扩 增；
[0009] 步骤4) RT-LAMP扩增反应结束后，将中和探针液加入RT-LAMP反应管中，95 °C水浴 5min，室温放置30s;
[0010] 步骤5)将胶体金核酸层析试纸条浸至管底，30s后取出观察结果。
[0011] 优选的是，所述步骤2)中的LAMP反应体系总体积为25μ1，反应体系如下： l〇x ThermoPol bul'lcr 2.5μ1 dNTP ( 10 mM each) 2.5μ1 Bct.ainc( I Μ) 2.5μΙ MgS〇4(l〇〇mM) 2.0μΙ
[0012] F3 和 Β3(10μΜ) ^ 0.5μ! 1?Ρ ?? BIP ( ΙΟμΜ) 各 4.0μΙ _AMV 逆转录酶（ lOU/μΙ) 0.2μL Bst DNA 聚介酚（lOU/μΙ) Ι.ΟμΙ 样品 0_8μ1
[0013] dd&O#足至25 μL
[0014] 上述任一方案优选的是，所述步骤3)中的恒温扩增是在62°C温度下恒温扩增 60min〇
[0015] 上述任一方案优选的是，所述步骤2)中的胶体金核酸层析试纸条包括样品垫、金 标结合垫、硝酸纤维素包被膜和吸水垫，所述样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素包被膜和吸 水垫均设置在底板上部，硝酸纤维素包被膜上设有膜固定探针。
[0016] 上述任一方案优选的是，所述样品垫和吸水垫设置在底板的两端，金标结合垫的 一端设置在样品垫底部另一端延伸至硝酸纤维素包被膜上部，硝酸纤维素包被膜的一端设 置在金标结合垫的下部，另一端设置在吸水垫的下部。
[0017] 上述任一方案优选的是，所述硝酸纤维素包被膜上设有测试线和质控线，测试线 和质控线均为直线。
[0018] 上述任一方案优选的是，质控线的两侧均设有膜固定探针。膜固定探针包括质控 膜固定探针和检测膜固定探针，试纸条质控线和检测线处分别设有质控膜固定探针和检测 膜固定探针。
[0019] 上述任一方案优选的是，所述吸水垫为吸水滤纸。
[0020] 上述任一方案优选的是，所述底板为PVC底板。
[0021 ]本发明还提供一种胶体金核酸层析试纸条的制备方法包括以下步骤：
[0022] 步骤1)制备胶体金溶液:将氯金酸水溶液与柠檬酸三钠水溶液混合后加热至沸 腾，用超纯水定容，得到胶体金溶液；
[0023] 步骤2)功能化胶体金溶液的制备:取步骤1)中制备的胶体金溶液，离心弃上清，得 到纳米金沉淀;流动相探针与吸附缓冲液混匀后加入到纳米金沉淀中，将沉淀重悬，再离 心，弃上清;加入吸附缓冲液重悬沉淀，得到功能化胶体金溶液，置4°C备用；
[0024] 步骤3)制备胶体金核酸层析试纸条:用步骤2)的功能化胶体金溶液均匀浸湿金标 结合垫，室温阴干后，放在底板中；膜固定探针与链霉亲和素混匀，室温放置2h后，将质控探 针中的膜固定探针点样于质控线处，检测探针中的膜固定探针点样于测试线处，点样体积 为0·15μ1〇
[0025] 上述任一方案优选的是，质控探针中的膜固定探针和检测探针中的膜固定探针点 样体积均为〇.15μ1，点样后室温放置2h阴干，置4°C冰箱。
[0026]优选的是，所述步骤1)取100mL0.01 %氯金酸水溶液，与2.5mLl %的柠檬酸三钠水 溶液混合后加热至沸腾并持续沸腾5分钟，冷却后用超纯水定容至100ml容量瓶中，4°C保存 备用。
[0027] 上述任一方案优选的是，所述步骤2)中取步骤1)制备好的胶体金溶液lml，4°C 14000rpm离心20min，弃上清，得到纳米金沉淀;流动相探针各取6μ1，与82μ1吸附缓冲液混 匀成100μΙ体系，加入到纳米金沉淀中，将沉淀重悬，4°C，12h弃上清；加200μ1蒸馏水， 14000rpm离心10min，弃上清;加20μ1吸附缓冲液重悬沉淀，得到功能化胶体金溶液，置4°C 备用。此处流动相探针包括HCV流动相探针、HIV流动相探针和质控探针的流动相探针三种。
[0028] 本发明还提供一种根据上述任一项所述的多重核酸层析快速检测方法在检测核 酸样本中的应用。
[0029]本发明提供一种多重核酸层析快速检测方法及应用，将RT-LAMP环介导逆转录等 温扩增技术和核酸探针杂交技术及胶体金层析技术结合，建立了基于胶体金-LAMP技术的 HIV/AIDS和HCV多重核酸层析快速检测方法，实现多重LAMP产物的检测。本发明包括HIV和 HCV RT-LAMP检测体系的建立和胶体金核酸层析法检测多重LAMP反应产物两个部分。胶体 金检测试纸由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫组成，所述样品垫、金标结合 垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫由底板的一侧依次粘贴。根据测试线和质控线的显色情况进 行结果判定，若质控线和测试线均显色，为阳性结果;若质控线显色而测试线不显色，为阴 性结果;若质控线不显色，为试纸条失效，该试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体 中特异性基因的检测。本研究将核酸探针杂交技术与胶体金层析技术结合，通过胶体金核 酸层析法对多重LAMP反应产物进行检测，检测过程不需要昂贵的专业仪器设备，降低了检 测成本，提高了检测效率，为基层医疗卫生单位和大规模人群HIV和HCV的早期筛查，提供一 种特异性强、灵敏度高、速度快的核酸检测方法。
[0030] 本发明主要具有以下几个方便的优势：
[0031] (1)特异性强，用于LAMP扩增的4条引物分