μΜ HCV和HIV-1 中和探针等体积混匀，RT-LAMP 62°C60min后，将 1.8ylHCV和 HIV-1中和探针混合液加入RT-LAMP反应管中，95°C水浴5min，室温放置30s后，将胶体金核 酸层析试纸条浸至管底，30s后取出观察结果。
[0088] (8)结果判定
[0089] 根据测试线I6(HIV-1)、测试线II7(HCV)和质控线8的显色情况进行结果判定。如 附图2所示，若质控线8显色，测试线I6(HIV-1)、测试线II7(HCV)均不显色，可判定为阴性结 果；如附图3所示，若质控线8和测试线I6(HIV-1)显色，测试线II7(HCV)不显色，可判定为 HIV-1核酸检测阳性，HCV核酸检测阴性;如图4所示，若质控线8和测试线II7(HCV)显色，测 试线I6(HIV-1)不显色，可判定为HCV核酸检测阳性，HIV-1核酸检测阴性;如图5所示，若质 控线8、测试线II7(HCV)和测试线I6(HIV-1)均显色，可判定为HCV和HIV-1混合感染;如图6 所示，若质控线8不显色，无论测试线II7(HCV)和测试线I6(HIV-1)条带如何，则该试纸条失 效，由图2-图5可见，所制备的胶体金核酸层析试纸条能够区分不同扩增序列，实现多重RT-LAMP检测。
[0090]本发明提供一种多重核酸层析快速检测方法及应用，将RT-LAMP环介导逆转录等 温扩增技术技术、探针杂交和胶体金层析技术进行结合，建立了基于胶体金-LAMP技术的 HIV/AIDS和HCV多重核酸层析快速检测方法，实现多重LAMP产物的检测。本发明包括HIV和 HCV RT-LAMP检测体系的建立和胶体金核酸层析法检测多重LAMP反应产物两个部分。胶体 金检测试纸由样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素包被膜3(NC膜）、吸水垫4组成，所述样品垫1、 金标结合垫2、硝酸纤维素包被膜3、吸水垫4由底板5的一侧依次粘贴。根据测试线16 (HIV-1)、测试线117(!1〇0和质控线8的显色情况进行结果判定，若质控线8显色，测试线16(!^-1)、测试线II7(HCV)均不显色，可判定为阴性结果;若质控线8和测试线I6(HIV-1)显色，测 试线II7(HCV)不显色，可判定为HIV-1核酸检测阳性，HCV核酸检测阴性;若质控线8和测试 线II7(HCV)显色，测试线I6(HIV-1)不显色，可判定为HCV核酸检测阳性，HIV-1核酸检测阴 性;若质控线8、测试线II7(HCV)和测试线I6(HIV-1)均显色，可判定为HCV和HIV-Γ混合感 染;若质控线8不显色，无论测试线II7(HCV)和测试线I6(HIV-1)条带如何，则该试纸条失 效。该试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测。本研究将核酸 探针杂交技术与胶体金层析法结合，通过胶体金核酸层析法对多重LAMP反应产物进行检 测，检测过程不需要昂贵的专业仪器设备，降低了检测成本，提供了检测效率，适用基层医 疗卫生单位和大规模人群HIV和HCV的早期筛查，提供一种特异性强、灵敏度高、速度快的双 标记核酸恒温扩增方法。
[0091]本发明主要具有以下几个方面的优势：
[0092] (1)特异性强，用于LAMP扩增的4条引物分别对应于靶基因的6个不同区段，理论上 可以检测出一个碱基差异的序列，因而具有比PCR更高的特异性。
[0093] (2)灵敏度高，LAMP能在模板DNA纯度很低的情况下进行扩增，很少受培养介质和 生物学物质的影响，纯化步骤可以忽略。
[0094] (3)速度快，LAMP是恒温扩增反应，在30~60min内即可完成反应过程，lOmin内即 可完成扩增反应，结合本发明中试纸条检测手段，试纸检测可在5min内完成，加上前处理过 程，可在1小时左右完成对样品的检测。
[0095] (4)易推广，LAMP反应是一个恒温扩增过程，不用控制温度变化，该技术不需要精 密的仪器设备仅需水浴锅或加热器维持反应温度，大大节省了检测成本和时间。
[0096] (5)安全性:该技术不需要用到特殊试剂，避开凝胶电泳中EB等污染物，对操作者 和试验环境都是安全无害的。
[0097] (6)该方法采用核酸检测，同样适用于早期筛查。
[0098]需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管 参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行 等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方 案的范围。
【主权项】
1. 一种多重核酸层析快速检测方法，包括W下步骤： 步骤1)、根据待测核酸样品，设计引物并进行合成，中和探针、膜固定探针的制备，膜固 定探针5 '端标记生物素，流动相探针3 '端标记琉基； 步骤2)、制备胶体金核酸层析试纸条，将功能化胶体金溶液均匀浸湿金标结合垫，膜固 定探针与链霉亲和素混匀，将质控探针中的膜固定探针和检测探针中的膜固定探针分别点 样于质控线处和测试线处； 步骤3)、将步骤1)设计好的引物加入LAMP反应体系中对待测核酸样品进行恒溫扩增； 步骤4)、RT-LAMP扩增反应结束后，将中和探针加入RT-LAMP反应管中，95°C水浴5min， 室溫放置30s; 步骤5 )、将胶体金核酸层析试纸条浸至管底，30s后取出观察结果。2. 如权利要求1所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述步骤2)中的 LAMP反应体系总体积为25μ1，反应体系如下： Ι()χ ThcrmoPol buiTcr 2.5μ1 dNTP ( lOmM each) 2.5μ1 Bclainei 1 Μ) 2.5μ1 MgSCh(lOOmM) 2,0μ1 F3 和 Β3(1〇μΜ) fr 〇.5μ1 F巧棘 B巧（ΙΟμΜ ) 各 4.0μΓ AMY 逆巧.础聊：（lOU/μΙ) 0.2μ1 Bsl DNA 娘合鹏（1 Ου,'/μΙ ) 1 ,ΟμΙ 样晶 化.8:μ.1 加化0补化午;25 μ!3. 如权利要求1所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述步骤3)中的 恒溫扩增是在62°C溫度下恒溫扩增60min。4. 如权利要求1所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述步骤2)中的 胶体金核酸层析试纸条包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素包被膜和吸水垫，所述样品 垫、金标结合垫、硝酸纤维素包被膜和吸水垫均设置在底板上部，硝酸纤维素包被膜上设有 膜固定探针。5. 如权利要求4所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述样品垫和吸 水垫设置在底板的两端，金标结合垫的一端设置在样品垫底部，另一端延伸至硝酸纤维素 包被膜上部，硝酸纤维素包被膜的一端设置在金标结合垫的下部，另一端设置在吸水垫的 下部。6. 如权利要求4所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述硝酸纤维素 包被膜上设有测试线和质控线，测试线和质控线均为直线。7. 如权利要求6所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述质控线的两 侧均设有膜固定探针。8. 如权利要求4所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述吸水垫为吸 水滤纸。9. 如权利要求4所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述底板为PVC 底板。10. 如权利要求1所述的一种多重核酸层析快速检测方法，其特征在于:所述胶体金核 酸层析试纸条的制备方法包括W下步骤： 步骤1 )、制备胶体金溶液:将氯金酸水溶液与巧樣酸Ξ钢水溶液混合后加热至沸腾，用 超纯水定容，得到胶体金溶液； 步骤2)、功能化胶体金溶液的制备：取步骤1)中制备的胶体金溶液，离屯、弃上清，得到 纳米金沉淀;流动相探针与吸附缓冲液混匀后加入到纳米金沉淀中，将沉淀重悬，再离屯、， 弃上清;加入吸附缓冲液重悬沉淀，得到功能化胶体金溶液，置4°C备用； 步骤3)、用步骤2)的功能化胶体金溶液均匀浸湿金标结合垫，室溫阴干后，放在PVC底 板;膜固定探针与链霉亲和素混匀，室溫放置化后，在金免疫层析试纸条上进行点样。
【专利摘要】本发明提供一种多重核酸层析快速检测方法及应用，将RT-LAMP技术、核酸探针杂交技术和胶体金层析技术进行结合，实现多重LAMP产物的快速检测。胶体金检测试纸由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫组成，根据测试线和质控线的显色情况进行结果判定，本研究将核酸探针杂交技术与胶体金层析法结合，通过胶体金核酸层析法对多重LAMP反应产物进行检测，检测过程不需要昂贵的专业仪器设备，降低了检测成本，提供了检测效率，适用基层医疗卫生单位和大规模人群HIV和HCV的早期筛查。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105567828
【申请号】CN201610053424
【发明人】张勤, 杨文杰, 侯瑞生, 张芳
【申请人】张勤
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月26日