的信号放大核酸适配体传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农产品质量安全检测技术领域，具体涉及一种测定黄曲霉毒素 m的信 号放大核酸适配体传感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是谷物、花生、玉米、油籽等多种粮食和饲料中常见的 真菌毒素污染物，已经成为影响食品安全、危害人类和动物健康的巨型杀手。黄曲霉毒素是 一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的二氢呋喃香豆素的衍生物，目前已经发现的有AFBhAFBs、 AFGi、AFG2、AFMi和六?12等18种，具有诱导突变、抑制免疫和致癌作用，被世界卫生组织的癌 症研究机构划定为I类致癌物质。天然食物中以六?8 1最为多见，其危害性也最强。AFBi的毒性 要比呕吐毒素的毒性强30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性强20倍;AFBj^急性毒性是氰化钾的 10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨 苯高900倍，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。因此，目前世界上很多国家已经 对食品和饲料中的AF含量提出了严格的限量标准，其中尤以欧盟提出的标准最为苛刻，规 定AFBi含量不得超过2ppb，总AF含量不得超过4ρρ1^ΑΡΒι的快速、灵敏、准确分析对于减少AF 对人类生命安全的危害、保证国际进出口贸易的畅通具有极其重要的作用。目前AFBi的检 测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、酶联免疫法(ELI SA)等。这些方法 虽取得了较大进展，但仍然存在操作要求高、步骤过于繁琐、灵敏度较差、误检率高、仪器昂 贵等不同缺陷。
[0003] 核酸适配体是一段单链寡核苷酸(20~60碱基），通过折叠能够形成特有的三维结 构，从而与靶分子高亲和力、高特异性结合。与抗体相比，核酸适配体的优点在于:特异性 高、容易进行化学合成、改造与标记、生物化学稳定性好，能可逆地进行变性与复性，还能充 分利用工具酶进行扩增、剪切等后续信号放大处理。各种基于核酸适配体的分析、检测方法 与技术已呈现出快速、灵敏、方便、低成本等优点，在生物医学应用中已经显示出广阔的应 用前景，但在真菌毒素检测方面的应用却相对较少。
[0004] 电化学生物传感检测方法具有快速、灵敏、仪器设备简单等特殊优势。近年来国内 外研究者对AFBi的电化学生物传感器的构建进行了多方面的努力和尝试，分别研究了以抗 体、DNA和酶作为识别元素的电化学生物传感器，并将纳米技术、离子液体、导电聚合物等技 术应用于AFBj^分析中，极大地丰富了电化学生物传感器和真菌毒素分析的研究内容和思 路。
[0005] 所以，本发明利用新型分子识别元件一一核酸适配体的高特异性特点，结合核酸 外切酶循环酶切的信号放大功能，同时利用电化学简单快捷、高灵敏的优点，构建了一种测 定黄曲霉毒素出的信号放大核酸适配体传感器。
【发明内容】
[0006] 为了解决目前AFBi检测成本高、假阳性率高、检测时间过长的缺点，本发明提供了 测定AFBj^信号放大核酸适配体传感器，采用AFBi核酸酸适配体作为分子识别元件，丝网印 刷电极作为换能器，核酸外切酶作为信号放大工具。在本发明中，AFBi的出现能够引发核酸 外切酶的酶切循环放大反应，产生较强的电化学信号放大效果。
[0007] 一种测定黄曲霉毒素也的信号放大核酸适配体传感器，巯基修饰探针通过金-硫 键结合到丝网印刷电极的金电极上，AFBi核酸适配体通过结合到电极表面的巯基修饰探针 杂交，组装到电极上，核酸外切酶在电极表面参与反应。
[0008] 所述巯基修饰探针为3 '端修饰有巯基，5 '端修饰有二茂铁的巯基探针，其序列如 SEQIDN0:1所示;AFB1核酸适配体序列如SEQIDN0 :2所示。
[0009] 一种测定黄曲霉出的信号放大核酸适配体传感器的制备方法，制备步骤如下：
[0010] (1)在丝网印刷电极的金电极表面滴加3yL含有ΙμΜ疏基修饰探针的1 X AFBi结合 缓冲溶液，于4°C下自组装12h;然后，电极用1XBB溶液清洗3次以除去弱吸附的探针;随后， 电极在ImM巯基乙醇溶液中室温封闭30min;接着往电极表面滴加 ΙμΜ 1 X BB稀释的六?81适 配体毒素溶液50此，于37°C下杂交2h，然后用1ΧΒΒ清洗3次后，将电极清洗干净后于4°C吹 干，得到修饰好的电极；
[0011] (2)在修饰好的电极表面滴加50yL含有AFBjP核酸外切酶的1 X BB溶液，室温反应 20min，用1 X BB清洗3次后即可进行差示脉冲电化学检测。
[0012] 所述lXAFBi结合缓冲溶液与1XBB溶液相同，组分为10mM Hepes，120mM NaCl， 5mM KCl，5mM MgCl2，pH 7.0。
[0013] 一种测定黄曲霉也的信号放大核酸适配体传感器作为检测玉米中黄曲霉毒素也的 应用。本发明的有益效果在于：
[0014] (1)本发明采用AFBJS酸适配体作为分子识别元件，与基于抗体的免疫检测技术 相比，具有非常好的特异性;同时，因核酸的合成成本非常低廉，且已经商业化，大大降低了 AFBi的检测成本。
[0015] (2)本发明采用AFBi采用丝网印刷电极作换能器，采用核酸外切酶酶切循环放大 信号放大策略，具有结构简单、加工简便、成本低廉、便于批量制备、检测灵敏度高等特点。
【附图说明】
[0016] 图1为测定黄曲霉毒素出的信号放大核酸适配体传感器检测原理图；
[0017] 图2为测定黄曲霉毒素 m的信号放大核酸适配体传感器的现象图；
[0018] 图3为标准工作曲线及线性范围。
【具体实施方式】
[0019] -种测定黄曲霉毒素仏的信号放大核酸适配体传感器(如图1所示），巯基修饰探 针通过金-硫键结合到丝网印刷电极的金电极上，AFBi核酸适配体通过结合到电极表面的 巯基修饰探针杂交组装到电极上，核酸外切酶在电极表面参与反应，起信号放大的作用。
[0020] 所述探针为3端修饰有疏基，5端修饰有二茂铁的疏基探针，其序列如SEQ ID NO:1所示;AFBi核酸适配体序列如SEQ ID NO:2所示。
[0021] -种测定黄曲霉出的信号放大核酸适配体传感器的制备方法，制备步骤如下：
[0022] (1)在丝网印刷电极的金电极表面滴加3yL含有ΙμΜ巯基修饰探针的1 X AFBi结合 缓冲溶液，于4°C下自组装12h;然后，电极用1XBB溶液清洗3次以除去弱吸附的探针;随后， 电极在