ImM巯基乙醇溶液中室温封闭30min;接着往电极表面滴加 ΙμΜ 1 X BB稀释的六?81适 配体毒素溶液50此，于37°C下杂交2h，然后用1ΧΒΒ清洗3次后，将电极清洗干净后于4°C吹 干，得到修饰好的电极；
[0023] (2)在修饰好的电极表面滴加50yL含有AFBjP核酸外切酶的1 X BB溶液，室温反应 20min，用1 X BB清洗3次后即可进行差示脉冲电化学检测。
[0024] 所述lXAFBi结合缓冲溶液与1XBB溶液相同，组分为10mM Hepes，120mM NaCl， 5mM KCl，5mM MgCl2，pH 7.0。
[0025] 一种测定黄曲霉也的信号放大核酸适配体传感器作为检测玉米中黄曲霉毒素也的 应用，具体步骤如下：
[0026] (1)电化学信号放大检测
[0027]电化学检测在CHI 660E型电化学工作站上于室温条件下进行:往清洗后的电极表 面滴加50yL 1 X BB溶液；电化学实验使用通用的丝网印刷电极:工作电极为修饰好的金电 极，铂电极为辅助电极，氯化银作参比电极。
[0028]该检测方法的信号放大效果如图2所示，当AFBiF存在的情况下，核酸外切酶不能 切割双链杂交复合物。DNA双链的形成具有一定的刚性作用，因红色探针上二茂铁与电极之 间的距离较大，导致二茂铁电活性基团到电极之间的电子转移比较困难或者无法进行，因 此电极上电流信号较小或者可以忽略不计。当AFBi存在的情况下，发生链置换反应，即AFBi 与核酸适配体的结合力大于杂交复合物之间的杂交作用力，从而导致杂交双链复合物的解 离，形成AFBi与核酸适配体的结合复合物，释放出单链的二茂铁电活性基团修饰探针，该探 针自身很容易形成发夹结构，从而拉近二茂铁与电极之间的距离，促使二茂铁电活性基团 到电极之间的电子转移比较容易，因此电极上出现电流信号。核酸外切酶能够识别AFBA 核酸适配体的结合复合物，从而降解核酸适配体释放出AFBi，AFBi又可以跟杂交双链复合物 反应，如此循环，实现信号放大。
[0029] (2)利用AFBi#准溶液建立标准曲线
[0030] 在修饰好的电极表面滴加50yL含有0. lpM AFBjP核酸外切酶的1 XBB溶液，室温 反应20min，再用1 X BB清洗3次后，进行DPV电化学检测，记录峰电流值;其他浓度的AFB!# 准液（ΙρΜ、ΙΟρΜ、ΙΟΟρΜ、ΙηΜ、10ηΜ、20ηΜ、40ηΜ、60ηΜ、80ηΜ、ΙΟΟηΜ)按以上实验操作依次进行 DPV测量，并记录相应的峰电流值如下表所示；
[0031] 表1不同浓度AFBi标准液DPV测量数据分析
[0032]
[0033] 以峰电流值作纵坐标，以AFBi浓度作横坐标作图，建立测定黄曲霉毒素出的信号放 大核酸适配体传感器的标准曲线（图3A为方法的动态测量范围，图3B为方法的线性范围）。 [0034] (3)检测含有AFBj^玉米实际样品
[0035]称取20g已粉碎的玉米样品，加入100mL磷酸盐缓冲液，振荡提取lh，过滤，取适量 滤液用1 X BB溶液稀释备用；往修饰好的电极表面滴加50yL含有未知浓度的AFBJP核酸外 切酶的1 X BB溶液，室温反应20min，再用1 X BB清洗3次后，进行DPV电化学检测，记录峰电流 值。
[0036]利用上述(2)所建立的黄曲霉毒素出标准曲线，计算出所述未知浓度的AFBi溶液中 的AFBd*度如表2所示。
[0037] 表2玉米实际样品中AFBi的检测
[0038]
[0039]本发明还可应用于谷物、花生、油籽等多种粮食中黄曲霉毒素出的检测。
【主权项】
1. 一种测定黄曲霉仏的信号放大核酸适配体传感器，其特征在于：巯基修饰探针通过 金-硫键结合到丝网印刷电极的金电极上，AFBi核酸适配体通过结合到电极表面的巯基修 饰探针杂交组装到电极上，核酸外切酶在电极表面参与反应。2. 如权利要求1所述的测定黄曲霉毒素也的信号放大核酸适配体传感器，其特征在于： 所述巯基修饰探针为3 '端修饰有巯基，5 '端修饰有二茂铁的巯基探针，其序列如SEQ ID N0:1所示;AFB1核酸适配体序列如SEQIDN0 :2所示。3. -种测定黄曲霉也的信号放大核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于:制备步骤 如下： (1) 在丝网印刷电极的金电极表面滴加3yL含有ΙμΜ疏基修饰探针的1 X AFBi结合缓冲溶 液，于4°C下自组装12h;然后，电极用1XBB溶液清洗3次以除去弱吸附的探针;随后，电极在 ImM巯基乙醇溶液中室温封闭30min;接着往电极表面滴加 ΙμΜ 1 X BB稀释的六?81适配体毒 素溶液50yL，于37°C下杂交2h，然后用1ΧΒΒ清洗3次后，将电极清洗干净后于4°C吹干，得到 修饰好的电极； (2) 在修饰好的电极表面滴加50yL含有AFBjP核酸外切酶的1 X BB溶液，室温反应 20min，用1 X BB清洗3次后即可进行差示脉冲电化学检测。4. 如权利要求1或3所述的测定黄曲霉毒素也的信号放大核酸适配体传感器，其特征在 于：所述1 XAFBi结合缓冲溶液与1 XBB溶液相同，组分为10mM Hepes，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2，pH 7·0〇5. -种测定黄曲霉也的信号放大核酸适配体传感器作为检测玉米中黄曲霉毒素也的应 用。
【专利摘要】本发明属于农产品质量安全检测技术领域，具体涉及一种测定黄曲霉毒素B1的信号放大核酸适配体传感器及其制备方法。该信号放大核酸适配体传感器中的巯基修饰探针通过金-硫键结合到丝网印刷电极的金电极上，AFB1核酸适配体通过结合到电极表面的巯基修饰探针杂交组装到电极上，核酸外切酶在电极表面参与反应。本发明采用AFB1核酸适配体作为分子识别元件，与基于抗体的免疫检测技术相比，具有非常好的特异性；同时，因核酸的合成成本非常低廉，且已经商业化，大大降低了AFB1的检测成本；采用AFB1采用丝网印刷电极作换能器，采用核酸外切酶酶切循环放大信号放大策略，具有结构简单、加工简便、成本低廉、便于批量制备、检测灵敏度高等特点。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105567836
【申请号】CN201610069597
【发明人】王红旗, 刘继红, 张迪, 尹海燕, 俎建英, 孙江南, 祁玉峰, 张玲
【申请人】河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月1日