用于培养被限制在微型生物反应器中的微生物的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于培养被限制在微型生物反应器中的微生物的新方法。
[0002] 更具体地，本发明允许在限制的介质中，持续长孵育时间（>24h)动态监测微生物 的培养。
【背景技术】
[0003] 具体地，根据法国专利号11/00659已知在限制的介质中实施微生物的培养;该申 请具体地描述了方法和装置，用于在水相1C液器(reservoirs aqueux)中动态监测与限制 的微生物的反应。该方法基于在管中一系列的水相1C液器的关联(r6f 6rencement)，其中一 连串的水相1C液器被隔离流体（f luide d ' espacement)隔开并且被载体流体（f luide porteur)运载。然而，所述方法不允许检测具有生长或者生物活性的微生物，所述生长或者 生物活性将改变界面。在这种情况下，在24h时及其后，贮液器的完整性不再保留：它们或融 合一起，或者它们再分为更小的贮液器。一旦失去至少一个贮液器，则同样失去关联，那么 不再可能对实验结果进行解释，和/或当一个所述贮液器的尺寸存在变化时，例如通过渗 漏;在这后一种情况下，内部测量的代谢物的浓度将会通过浓度效应而被人为地增加，并不 是因为所考虑的所述贮液器中所含的微生物是代谢物的超级生产者。
[0004] 一般来说，现有技术不允许有效限制所有类型的微生物的持续时间长于24h。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是可以研究整个生命周期，而无需考虑微生物的类型、它们的生物 活性和生长率。
[0006] 更具体地，本发明用于培养被限制在微型生物反应器中的微生物的方法，其中所 述微型生物反应器是这样的一种类型，其包含毛细管，毛细管中流通有旨在引起液滴的队 列（train de gouttes)向前移动的载体流体，所述微型生物反应器被隔离流体隔开，这种 流体为气体。
[0007] 根据本发明的一个优选的实施方案，发生所述微生物的培养的微型生物反应器的 直径小于所述毛细管的直径。
[0008] 有利地，所述隔离流体的泡的尺寸在所述毛细管的直径的2至10倍范围内。
【附图说明】
[0009] 本发明的方法通过参照附图阅读以下说明将更好理解，附图以示意方式单独给 出，其中：
[0010] -图1示意性地示出了现有技术中液滴队列的构成；
[0011] -图2为现有技术中内部流通有液滴队列的毛细管的纵剖面图；
[0012] -图3为根据本发明内部流通有液滴队列的毛细管的纵剖面图；以及
[0013] -图4为本发明的方法中所使用的装置组件的简化图示。
【具体实施方式】
[0014] 如图1所示，如通常情况，液滴队列由三个互不混溶的相（I)、（II)和（III)形成，其 中各个相来源自贮液器(未示出），阀（例如，电磁阀或者气动阀，未示出）允许不同的相释放 至它们各自的管（1)、（2)和(3)，所述的管（1)、（2)和(3)聚合至十字路交叉点，在该处形成 所述液滴，其中的一个分支(4)是毛细管，液滴队列在其内部流通。相（I)形成载体流体，相 (II)形成培养微生物的液滴，以及相(III)形成隔离流体，这些将在本说明中进一步详细说 明。不同液滴间的尺寸和间距取决于交叉点的几何结构以及相的注射流速间的比例。最后， 将微生物包囊在相(II)的液滴内部遵循泊松定律。
[0015] 现有技术以及尤其是在法国专利号11/00659中，教导了如何形成前述的液滴队 列;本发明不涉及这种获得所述液滴队列的方法。
[0016] 图2提供了由液滴(5)所形成的传统的液滴队列的部分更清晰的视图，液滴(5)包 含反应混合物，微生物在其中发育，液滴队列彼此被隔离流体的液滴(6)隔开以防止液滴 (5)融合一起;通过在毛细管(8)内部的载体流体(7)向前运载液滴(5)和(6)，所述载体流体 (7)允许液滴的移动和毛细管(8)的润滑，防止连贯的液滴(5)之间的污染。毛细管是指一种 内径小于2mm的管。
[0017] 如前所述，液滴队列是由三个不混溶的相所形成。载体流体（I)通常为全氟化油 ("液态聚四氟乙烯"），其对包含在微型生物反应器中的微生物不具有任何毒性。为确保队 列适当的形成，以及避免液滴之间的任何污染问题，与对其他相相比，该载体油对毛细管具 有更高的亲和力(affinity)。
[0018] 第二水相（II)含有细胞和培养介质。
[0019] 最后，第三相（III)不与前二者混合;它可由流体形成，例如碳氢化合物或矿物油。
[0020] 已经回顾了现有技术中形成的液滴队列，允许在这些液滴中培养微生物，本说明 现在将关注已知方法的改进，从而克服所述方法的缺陷。
[0021] 在本说明余下内容中，培养微生物的液滴(5)将被称为微型生物反应器5。
[0022]本发明的方法可应用于不同的微生物，且尤其是丝状真菌（champignons filamenteux)和浮游藻（algues planctoniques) 〇
[0023] 丝状真菌形成疏水性细丝(filaments)(菌丝），能够从一个微型生物反应器穿过 载体流体，延伸至另一个。如果使用由碳氢化合物组成的隔离流体，细丝能够借此完全穿过 直至临近的微型生物反应器。它们还可在微型生物反应器/碳氢化合物界面形成生物膜，其 将逐渐地完全阻塞毛细管的横截面。这种现象导致队列的破坏以及实验的终止。
[0024]这是本发明的方法的特征之一，已发现为解决该问题可以使用气体作为隔离流 体。然而，如果微型生物反应器过大且与毛细管具有实质性接触表面区域，同样地可能发生 由丝状真菌的发育所导致的阻塞现象。这引起微型生物反应器(5)之间的污染问题，以及由 于细丝与毛细管(8)的相互作用导致的液滴队列稳定性问题。
[0025]关于浮游藻，在水相微型生物反应器(5)中和隔离泡（6)中，在液滴队列的边缘已 观察到自乳化的现象。这意味着在两种类型的隔室(compartiments)中，一个相中的液滴在 另一个中自发地形成。最可能的解释是在微型生物反应器中存在与藻共生的细菌。这些细 菌能够合成表面活性剂从而促进自乳化，且导致液滴队列的瓦解(effondrement) 〇
[0026] 对于浮游藻，使用气体作为隔离流体足以解决自乳化的问题。
[0027] 然而，对于丝状真菌，这种替换不足以确保队列的稳定性。这是本发明的方法的另 一个特征，随后该解决方案是减小微型生物反应器的尺寸，以便减少细丝与毛细管(8)的壁 之间的相互作用。
[0028] 在可以用作隔离流体的不同的气体中，由空气构成的使用是有利的，首先由于它 的湿润性，以及其次因为它提供了与在固体介质中发酵相接近的条件。
[0029] 根据实施方案的一个变化，使用氮气/二氧化碳的混合物作为隔离流体;当培养的 微生物为藻时，这种流体是尤其有利的，因为该混合物促进光合作用活性。
[0030] 不论所使用的隔离流体如何，其可以是气体混合物的形式，所述隔离流体必须： [0031 ]-与载体流体和微型生物反应器的内含物是不可混溶的；
[0032]-不与微生物相互作用，即微生物一定不能在隔离流体中生长或繁殖；
[0033]-没有毒性，即对微生物的生长有害。
[0034] 根据本发明的方法的一个优选的实施方案，微型生物反应器(5)的直径小于毛细 管(8)的直径;更优选地，微型生物反应器(5)的直径在毛细管(8)的直径的80和85%之间的 范围内。当在微型生物反应器(5)中培养的微生物是丝状真菌时，所述结构是尤其有利的。 低于80%的值，具有一连串空气泡形成的隔离流体(6)可能去接触微型生物反应器(5)底部 的风险，这将迅速引起隔离泡(6)和微型生物反应器(5)的融合。
[0035] 按照以下操作模式有利地制备用于丝状真菌生长的液滴队列。
[0036] 丝状真菌的孢子悬浮在PGS介质中（葡萄糖10g/L，胰蛋白胨6g/L，MgS〇4 7H20 0.5g/L，KH2P04 0.5g/L，FeS