〇4 7H20 0.5mg/L，pH调整至5)。载体流体由Novec 7500氟化油 (HFE)组成。队列在内径为0.5mm的十字路交叉点形成，十字路交叉点连接至长度为15m且内 径为0.75mm的FEP毛细管。PGS介质和HFE油通过注射栗分别以5.0和3.5mL/h的流速注射。通 过长度为50cm和内径为0.2mm的管，通过电磁阀以0.5巴的压力注射空气。该管允许建立足 够的水动阻力（resistance hydrodynamique)以产生均勾的队列。在队列的每一边注射长 度为10cm的空气泡，以允许限制队列。
[0037] 此外，关于藻和丝状真菌的生长，观察到由于微型生物反应器(5)内部的生物活性 (呼吸和光合作用）导致的隔离空气泡(6)随时间减小。因此，如果隔离泡(6)在本发明的方 法的起始时太小，当其中一些消失时，导致已被隔开的微型生物反应器(5)的合并。有利地， 为获得超过90h的稳定队列，隔离泡(6)的尺寸必须比毛细管(8)的内径大至少10倍。
[0038] 研究了长持续时间的动力学，观察到边缘效应发生。这导致在队列两边的微型生 物反应器(5)的尺寸的减小，这能导致微型生物反应器(5)与其相邻近的合并。这种效应也 与这样的事实有关，即使用空气作为隔离流体促进蒸发。为克服这种现象，在本发明的方法 的一个优选的实施方案中，载体流体贮液器是经水饱和的，以允许队列的再循环 (recirculation)〇
[0039] 现描述本发明的方法的实施方案的实施例。
[0040] 1/溶液的制备：
[0041] -在培养介质中的微生物的悬液具有与目标占有率(细胞的数量/-微型生物反应 器)相对应的浓度
[0042]-添加有全氟化表面活性剂(0.06% )的水饱和的全氟化油
[0043] 2/使用以下生成液滴队列：
[0044]-载体流体:^^7500全氟化油+0.06%表面活性剂
[0045] -隔离流体:压缩空气
[0046] -反应物:微生物的悬液
[0047]调整三种流体的流速/压力的比例以获得：
[0048] a)微型生物反应器(5)的尺寸在管(8)内径的80%和85%之间；
[0049] b)隔离泡(6)的尺寸为管(8)内径的至少3倍；
[0050] 以上在a)和b)中给出的尺寸特征在图3中显示。
[0051] 3/在液滴队列的起点和末端以长泡(6)的形式添加隔离流体的终端塞。
[0052] 4/通过图像分析，质量控制液滴队列(80%〈微型生物反应器的尺寸〈85%)。
[0053] 5/在探测器(9)的前面通过液滴队列的向前和向后移动进行动态监测。
[0054] 6/分析对每个微型生物反应器所记录的数据。
[0055] 下表以示意方式归纳不同参数（隔离流体、微型生物反应器或隔离流体泡的尺 寸），以及给出了微生物的最大孵育时间作为这些参数的函数。
[0056]
[0057]以上表培养以下微生物：
[0058]-米曲霉(Aspergillus Oryzae)(丝状真菌）用于试验1-7和11;
[0059]-黑曲霉(Aspergillus Niger)(丝状真菌）用于试验8-10;
[0060]-莱茵衣藻(Chlamydomonas Reinhardti)(单细胞藻）用于试验 12-13。
[0061 ]关于上述的丝状真菌，在稳定性方面，试验9、10和11获得最佳结果。
[0062]通过本发明的方法所带来的改进，其可以证实可以在微型生物反应器中监测生长 和生物活性动力学，持续至今本领域技术人员难以达到的时间长度。
[0063]尽管藻和酵母在它们生长期间不会穿过载体油/培养介质屏障，该限制方法导致 液滴队列的稳定性提高，降低培养介质的液滴和管壁间的相互作用，需记住由于微生物在 它们生长时所分泌的代谢物导致的表面张力的下降，随时间影响队列的稳定性。最后，利用 气泡可允许调节气体交换，其作为氧气(丝状真菌的呼吸)或二氧化碳(藻的光合作用）的贮 库起作用。
[0064] 微型生物反应器(5)以线性队列排列，其可在数百至数千样本间变化。每一微型生 物反应器(5)通过其在队列中的排名而被识别。因此，对于确保持续长时间反应，微型生物 反应器的队列的完整性是至关重要的。设置微型生物反应器(5)不断地运动，以保持膜的润 滑，通过再循环使得微型生物反应器均匀化。如图3所示，队列以一个方向然后以另一个方 向经过探测器(9)的前面，可随时间监测每一微型生物反应器(5)内部的反应。微型生物反 应器(5)的队列也可以总是以相同的方向在探测器的前面经过，确保再循环回路，允许随时 间监测在每个微型生物反应器内发生的反应。
[0065] 此探测器(9)整合在一个孵育模块（10)中，孵育模块（10)具体包括一个栗（11)和 阀（12)(例如电磁阀或气动阀），以允许微型生物反应器的队列以一个方向然后以另外一个 方向流通，队列在部分A加载，接着向部分B移动到探测器(9)的前面。出口（13)的存在允许 除去不良的微型生物反应器(5)以及实验终止时清理回路。模块（14)使本系统完整(comply te)，在该模块中形成液滴队列（微型生物反应器和流体泡），其与图1相一致，具有含有相 (I)、（II)和（III)的不同贮液器。
【主权项】
1. 一种用于培养被限制在微型生物反应器中的微生物的方法，其中所述微型生物反应 器(5)是这样的一种类型，其在毛细管(8)的内部包含旨在向前移动的载体流体，由微型生 物反应器(5)形成的液滴的队列，在所述队列中发生微生物的培养，从而能够改变所述液滴 的界面，其中所述微型生物反应器(5)被隔离流体隔开，其特征在于所述隔离流体为气体。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述气体是空气。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述气体是氮气和二氧化碳的混合物。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述微型生物反应器(5)的直 径小于所述毛细管(8)的直径。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微型生物反应器(5)的所述直径在所 述毛细管(8)的直径的80%和85%之间。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述隔离流体是泡（6)的形 式，其尺寸在所述毛细管(8)的直径的2至10倍范围内。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述载体流体来源于水饱和 的贮液器。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养的微生物是丝状真 菌。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述丝状真菌是米曲霉Aspergillus Oryzae或黑曲霉Aspergillus Niger。10. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养的微生物是浮游 藻。11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述藻是莱茵衣藻Chlamydomonas Reinhardti 〇
【专利摘要】本发明涉及一种用于培养被限制在微型生物反应器中的微生物的新方法。所述方法包括使用毛细管，毛细管中运载流体用于移动液滴的队列向前流动，所述毛细管包括微型生物反应器，微型生物反应器中发生所述微生物的培养，其中所述微型生物反应器被隔离流体隔开，隔离流体为气体。微型生物反应器(5)的直径小于毛细管(8)的直径，并且所述隔离流体的泡(6)的尺寸在所述毛细管(8)的直径的2至10倍范围内。该方法可用于培养微生物，例如丝状的真菌或浮游藻。
【IPC分类】C12M3/06, C12M1/12
【公开号】CN105579571
【申请号】CN201480045675
【发明人】J·I·加尼卡罗德里格斯, L·布瓦塔尔, A·S·D·德勒韦勒, J·比贝特
【申请人】J·舒福莱企业公司, 巴黎城市物理化工高等学院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年7月10日
【公告号】CA2917039A1, EP3019590A1, US20160168524, WO2015004228A1