一种5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域、分子生物学领域。具体地，本发明涉及一种新型的抗 草甘麟的5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶巧-enolpyruv}^ shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)，W及编码上述合成酶的核酸序列，包含该序列或其编码片段的核酸构建 体，携有该序列或其编码片段或携有所述核酸构建体的载体，W及用所述构建体或载体转 化的宿主细胞。另外，本发明也涉及上述新型5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶，编码该 合成酶的核酸序列、核酸构建体，重组表达载体W及用所述构建体或载体转化的宿主细胞 的使用。
【背景技术】
[0002] 在农业生产上广泛使用除草剂进行杂草防治，但是除草剂常常在杀灭农作物中杂 草的同时会对农作物本身产生危害，而且会伤害许多商业作物和双子叶植物，如大豆、棉 花、马铃墓、油菜。利用转基因方法可W将抗除草剂基因导入农作物，从而使该农作物获得 除草剂耐受能力，因此使用除草剂能够选择性地杀灭杂草。在农田中喷洒除草剂只会杀灭 杂草但是不会对转基因的农作物产生药害，送样的系统被称为除草剂-抗除草剂的作物配 套系统。
[0003] 目前，一些抗除草剂基因已经被成功地应用于除草剂-抗除草剂的作物配套系 统。例如抗2,4-二氯苯氧己酸的tfdA基因，抗漠苯腊的BXN基因和抗草了麟的bar基因 和pat基因等。导入上述除草剂的植物细胞W及植株已被证明具有抗相应除草剂的功能。
[0004] 草甘麟属有机磯类内吸传导型灭生性除草剂，可W杀死杂草和植物。由于草甘麟 有效且生产成本低，对环境保护好，理化性质稳定并具有高效、广谱、低毒、低残留、易分解、 不破坏±壤环境和对大多数植物具有强灭生性等优点，目前已是世界范围内应用最为广 泛、非常重要的一种除草剂。但部分细菌的5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶已发现对草 甘麟具有抗性，因此通过基因工程被分离获得，经过转基因技术表达细菌的抗草甘麟功能 而获得抗草甘麟的能力。但是为了抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘麟 基因和W此为基础的抗草甘麟植物。然而，一种细菌的EPSPS是否抗草甘麟W及抗性的高 低，是不能通过EPSPS的氨基酸序列预测的。本发明提供一种新型抗草甘麟基因，该基因具 有很高的抗草甘麟能力，可W用来产生抗草甘麟植物，也可作为微生物和植物细胞培育中 的筛选标记。
【发明内容】
[0005] 本发明是一种新型的抗草甘麟5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶W及编码此酶 的核酸序列，用于转到寄主包括植物中，使得寄主特别是植物能耐受草甘麟，并且可W利 用本发明的5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶清除受草甘麟污染的资源。
[0006] 本发明一个目的是涉及编码草甘麟耐受型EPSI^基因的核酸序列（SEQ ID No:2)， W及其编码的氨基酸序列（SEQ ID No:l)，并克隆了其基因片段。该基因片段的序列与现有 技术中的±壤杆菌CP4 (Agrobacterium sp. CP4)抗草甘麟的5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸 合成酶基因序列存在差异性，通过同源性比对，结果只有53. 7%的同源性（图1)。证实了 该基因是新发明的。
[0007] 本发明还有一个目的是提供一种由上述核酸序列与使上述核酸序列在相应宿主 细胞中表达所必需的调控序列可操作地连接而形成的核酸构建体。所述调控序列具体可任 选包括启动子、增强子、前导序列、聚腺巧酸化信号、W及转录和翻译的起始和终止序列。
[0008] 本发明还有一个目的是提供一种含有上述核酸序列或核酸构建体的载体。
[0009] 本发明还同时提供了一种转基因植物细胞、部分宿主生物和完整的宿主生物，其 包含上述核酸序列。该植物细胞可W在适当的条件下表达上述核酸序列所编码的蛋白，并 使该蛋白具有EPSPS酶活性W及降解草甘麟的能力，从而使该转化的植物细胞具有草甘麟 耐受性。
[0010] 本发明还有一个目的是提供上述植物细胞及其后代细胞，送些细胞中含有上述核 酸序列或其编码片段、核酸构建体或载体，并且送些细胞具有草甘麟耐受性。
[0011] 本发明还有一个目的是提供一个在田间利用此类5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合 成酶转化的植物和使用草甘麟的除草方法。在植物的生长过程中，喷洒草甘麟。由于此类 5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶基因转化的植物具有草甘麟耐受性，喷洒的草甘麟可W 杀死杂草，但不杀死5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶基因转化的植物。因此利用草甘麟 可W选择性地控制植物生长中的杂草，不影响转化了的植物的生长。
[0012] 本发明还有一个目的是进一步提供了清除草甘麟对一些材料的污染的方法。此方 法包括利用本发明的微生物W及此类微生物的提取物或其产物，如分解草甘麟的5-帰醇 丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶，能分解草甘麟，使其不对环境产生危害。
[0013] 本发明还有一个目的是利用草甘麟耐受性的选择性标记基因筛选转化的植物细 胞或植物的方法。此方法包括用本发明的此类核酸转化至其中一部分植物细胞中，在含有 草甘麟的培养基中培养，使得转化的植物细胞可W生长；而非转化的植物细胞不能生长。此 方法也包括转化本发明的此类核酸的植物的筛选，其中成功转化的植物在喷洒草甘麟时可 W生长，而未转化的植物不能生长。
[0014] 本发明的其他目的还可W体现在W下对本发明的详细描述W及具体实施例中。
[0015] 本发明提供了从±壤及污水中分离的一种菌株，它能破坏除草剂草甘麟的活性， 避免在喷洒草甘麟时对宿主包括植物产生有害影响。此外，本发明还提供了一种从该菌中 分离的5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶，发挥着重要的作用，该酶发挥其降解草甘麟的 能力。
[0016] 本发明提供了一种抗草甘麟的EPSPS基因，并对该EPSPS基因克隆，对其进行序 列测定，如序列表中SEQ ID No:2所示。本发明的EPSPS基因序列与上述提到的±壤杆菌 CP4 (Agrobacterium sp. CP4)的5-帰醇丙丽莽草酸-3-磯酸合成酶基因氨基酸序列只有 53. 7%的同源性，核酸序列差异明显。
[0017] 本发明还提供了上述核巧酸序列的变体，例如在该序列的基础上进行任何改动， 如剪切、插入或替换一个或多个核巧酸，通过检测鉴定，如果所得新的核酸序列能编码具有 EPSPS活性的蛋白，郝么就属于本发明的内容。
[0018] 本发明还同时提供了上述基因编码的草甘麟蛋白，该蛋白质的氨基酸序列如序列 表中沈Q ID No:1所示。
[0019] 本发明中抗草甘麟的蛋白质也可W用人工方法引入一个或多个变异而获得保持 有抗草甘麟能力的变异分子，比如对该序列进行剪切、插入或替换一个或多个氨基酸残基， 通过筛选获得具有抗草甘麟能力的新的蛋白质分子，属于本发明的内容。
[0020] 将本发明编码EPSPS的核巧酸序列与相对于该序列同源或异源的其它序列可操 作地连接，就构成本发明的核酸构建体。本发明的抗草甘麟基因的核酸片段可W进一步构 建包含表达构件的植物转化质粒。送个表达构件包括启动子、抗草甘麟基因和终止子。
[0021] 送个抗草甘麟基因表达构件可W通过植物的转化被整合到植物的基因组中，从而 稳定遗传和表达。该表达构件可W通过农杆菌或基因枪等方法导入植物的未成熟胚、成熟 胚、未分化的愈伤组织或原生质体中表达。
[0022] 利用本发明的基因所编码的蛋白质序列，可W设计和人工合成密码子优化的有利 于在植物中表达的核巧酸序列。只要该序列具有草甘麟耐受性，就属于本发明的范围。利 用DM2. 0等软件对该基因的序列进行密码子优化，利用生物学软件DNAMAN等对优化后的 序列作限制性酶切分析，对含有常见酶切位点的密码子进行同义修饰，消除常用酶切位点。
[0023] 根据本发明的方法，可将本发明的核酸构建体，或者直接将本发明的分离的核酸 序列导入载体，用该载体转化特定的宿主细胞，从而表达本发明的EPSPS酶并使得该重组 宿主细胞获得草甘麟耐受性。或者不通过载体转化，而是直接将本发明的分离的核酸序 列，或本发明的核酸构建体用常规方法，如电穿孔等导入宿主细胞，同样可W表达本发明的 EPSPS酶并赋予该细胞草甘麟耐受性。如此所获得的载体和重组宿主细胞，W及获得该细胞 的方法，都包括在本发明的范围之内。
[0024] 本发明所提供的对植物进行改造的方法是；利用序列表中SEQ ID No:2所示的或 与其具有同源性的基因或对该基因序列进行植物密码子优化的基因转化植物细胞，再将转 化后的植物细胞培育成相应植株，从而使送些转基因植物获得抗草甘麟的能力。植物可选 大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、马铃墓、甘藍、白菜和青椒等。
[0025] 本发明涉及了常用草甘麟耐受性的选择性标记