优选至少93 %，优选至少 94 %，优选至少95 %，优选至少96 %，优选至少97 %，优选至少98 %，更优选至少99 %，最优 选为100%，只要具有所述同源序列的蛋白是草甘麟耐受性EPSPS蛋白，该序列就属于本发 明的范围。
[0050] 由本发明分离的核酸序列编码的蛋白，具有含序列表中SEQ ID No:l所示氨基酸 序列之EPSPS的活性至少20 %，优选至少40 %，更优选至少60 %，甚至更优选至少80 %，甚 至更优选90 %，最优选100 %。
[0051] 上述序列在所选宿主细胞中表达所必需的调控序列包含在本发明的核酸构建体 中。在核酸构建体中所述调控序列与上述分离的核酸序列进行可操作地连接。
[005引表达调控序列是DNA序列，涉及任何方式介入原核生物和真核生物中控制、转录 和翻译。合适的表达调控序列和制定使用它们的方法在本发明中体现。
[0053] 调控序列的表达必须包含一个启动子。该启动子可W是任何DNA序列其在所选的 宿主细胞或有机体中要有转录活性，启动子可W是诱导启动子或结构启动子。它可能是自 然发生的，由几种自然发生的激活子组成，部分的或完整的人工合成的。根据启动子的结构 引导引物的设计。许多适合的启动子在原核生物和真核生物中的应用体现在本发明中。
[0054] 调控序列可W是启动子序列，包括介导多肤表达的转录调控序列。启动子是宿主 细胞的RNA聚合酶专一结合并起始转录合成mRNA的部位。启动子可W是在细胞中显示转 录活性的任何核酸序列，包括突变的、缺失的及移位的启动子，而且可W从编码细胞外或细 胞内多肤的基因中得到，送些多肤与该细胞可W同源或不同源。
[00巧]调控序列也可W是适当的转录终止序列，例如本文所述的宿主细胞能识别并终止 转录的序列。人工合成的基因后面一定要装配合适的终止子，W减少能量消耗及保持转录 的准确性。该终止序列与编码多肤的核酸序列的3'端可操作地连接。宿主细胞中任何有 功能的终止子都可W使用在本发明中。
[0056] 调控序列可W是适当的前导序列，即mRNA上对细胞的翻译很重要的非翻译区。 前导序列与编码多肤的核酸序列的5'端可操作地连接。宿主细胞中任何有功能的前导序 列都可W使用在本发明中。
[0057] 调控序列也可W是聚腺巧酸化序列。该序列与核酸序列的3'端可操作地连接，而 且在转录过程中，被细胞作为信号来识别，从而将聚腺巧酸残基加到转录出的mRNA上。该 细胞中任何有功能的聚腺巧酸化序列都可W使用在本发明中。
[0058] 核酸构建体还可W包括一个或多个核酸序列，送样的核酸序列能编码一个或多个 有利于指导异源多肤表达的因子，例如，转录激活因子（如反式作用因子）、伴侣蛋白和加 工型蛋白酶。细菌细胞、植物细胞或其他任何宿主细胞中有效的因子都可W使用在本发明 中。编码一个或多个送些因子的核酸与编码异源多肤的核酸序列不一定串联。
[0059] 本发明将上述各种核酸和调控序列连接在质粒或瞻菌体等常规载体上，产生"重 组表达载体"。所述载体一般含有引导目的基因转录的启动子和目的基因。所述载体要有合 适的限制性核酸内切酶位点，送样有利于插入外来核酸片段，且插入后不影响其进入宿主 细胞和在细胞中的复制。此外，上述载体还要有容易识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、 或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞就容易被辨认和分离出来，有利于克隆操作。"重组 表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、瞻菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或其他载体。
[0060] 在载体整合入细胞基因组的过程中，该载体含有附加的核酸序列，能指导载体通 过同源重组整合入细胞基因组。送些附加的核酸序列能够使该载体整合入基因组中染色体 的精确位置。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件适宜优选包含足够数量的核酸， 例如100-1500个碱基对，优选400-1500个碱基对，最优选800-1500个碱基对，它们与 其相应的祀序列高度同源，W便提高同源重组的可能性。送些整合元件可W是任何与细胞 基因组中祀序列同源的核酸序列。而且，送些整合元件可W是非编码或编码型核酸序列。另 一方面，通过非同源重组可W将该载体整合入细胞的基因组中。
[0061] 在自主复制的过程中，该载体可W进一步包含使其能在细菌细胞和植物细胞中自 主复制的复制起始点。
[0062] 本发明还涉及含有本发明核酸序列的重组"宿主细胞"。将含有本发明核酸序列的 核酸构建体或载体导入宿主细胞中，从而使其得W在该宿主细胞中稳定表达，赋予该宿主 细胞抗草甘麟的能力。
[0063] 宿主细胞可W是原核生物，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母；或是局等真 核细胞，如植物细胞。常用的细菌细胞有革兰氏阳性细菌如芽抱杆菌的细胞，或革兰氏阴性 细菌如大肠杆菌和假单胞菌的细胞。一般更优选真核生物，如植物细胞。
[0064] 将表达载体引入细菌宿主细胞可通过农杆菌转化，利用感受态细胞，通过电穿孔 等作用而实现。其中转化和转导主要适用于原核的细菌细胞和低等的真核细胞；而显微注 射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。
[0065] 本发明的多核巧酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将 会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用 于启动子W增强基因的转录。
[0066] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，W提供用于选择转化的 宿主细胞的表现型性状，如新霉素抗性及绿色英光蛋白等。筛选转基因的植物或植物细胞 的方法都体现在本发明中。
[0067] 本发明的有益效果；本发明可W大幅度简化农作物的杂草防治方式，扩大草甘麟 的应用范围，同时本发明还可W消除草甘麟给环境带来的影响，净化环境。本发明的基因可 用于制备对草甘麟产生了抗性的转基因宿主包括植物，或者获得利用草甘麟选择性杀灭未 转化EPSPS基因宿主包括植物的方法。
[0068] 参考专献：
[0069] [1]EPSPS基因的克隆机转化甜高梁的初步研究，谢鸿错，导师；榻维言，广西大学 硕±学位论文；
[0070] 凹抗草甘麟EPSPS基因的专利保护分析，宋敏.刘丽军.苏颖异.张锐，中国生 物工程杂志，2010, 30(2) :147-152 ;
[0071] [3]抗草甘麟基因_EPSPS_的克隆与功能验证，程海刚，导师：郭Η堆.罗淑萍，新 疆农业大学硕±学位论文；
[0072] [4]耐草甘麟基因克隆和作物转化研究新进展，何迎春.任春梅.高必达，生物技 术，2001，11(4);
[0073] [引银杏EPSPS基因克隆及表达分析，程华.李琳玲.王燕等，西北植物学报， 2010,30(12) :2365-2372 ；
[0074] [6]芸苔EPSPs基因 cDNA的克隆和表达载体的构建，游大慧.琴宇.王建美等，四 川大学学报（自然科学版），2004, 41 (3)。
【附图说明】：
[00巧]图1本发明的EPSPS氨基酸和±壤杆菌CP4 (Agrobacterium sp. CP4化PSPS氨基酸 比较及同源性分析；A犯PSPS为本发明的氨基酸，CP4EPSPS为±壤杆菌CP4 (Agrobacterium SP.CP4)氨基酸。"-"为没有对应的氨基酸。
[007引图2SDS-PAGE蛋白电泳图；Μ为标准蛋白分子量；BL21为化21细菌的全体蛋白； 祀T28a为有质粒祀T28a-EPSPS的化21细菌蛋白。其中表达量最高的蛋白为EPSPS蛋白。
[0077] 图3细菌在平板上的培养；所有平板含有900mM草甘麟的Re化ced化lorine培养 基，细菌培养Η天W后的平板。A:祀T28a质粒DNA转化的化21细菌于37°C在培养基上无 生长；B:BL21细菌于37°C在含有草甘麟的培养基上无生长；C:本发明的菌株A9于3(TC在 含有草甘麟的培养基中生长；D:pET28a - A犯PSPS为EPSPS表达质粒DNA转化的化21细菌 于37°C生长在含有草甘麟的培养基上；结果表明，分离的菌株和转化EPSPS基因的化21在 含有草甘麟的培养基生长，而其他的对照没有生长。证明了 EPSPS基因草甘麟耐受性的功 能，即克隆的EPSPS是草甘麟耐受型基因，其基因表达产物可W解除草甘麟对宿主细胞的 毒性，并利用草甘麟生长。
[0078] 图4细菌在液体培养基上的生长；所有平板含有900mM草甘麟的Recced 化lorine培养基，化21为化21细菌；A9为本发明筛选的草甘麟耐受型细菌；D册α为 D册α细菌；JM109为JM109细菌；BL21-pET28a为表达质粒祀T28a DNA转化的化21细菌。 化21-A犯PSPS为祀T28a - A犯PSPS表达质粒DNA转化的化21细菌。结果表明，分离的菌株 和转化EPSPS基因的