一种水稻转基因成分的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物检测领域，特别设及一种水稻转基因成分的检测方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国主要粮食作物，水稻及其产品的转基因技术均已成熟，转基因水稻品 种的种植与推广需要严格审批，因此需要对转基因水稻进行监管，转基因成分检测是转基 因监管的技术支撑。
[0003] 现有的转基因成分检测技术主要检测核酸或蛋白质，其中，基于核酸的检测方法 主要流程为：提取待测样品中的核酸，利用PCR^olymerase化ainReaction，聚合酶链反应） 的方法扩增样品中的转基因成分，利用实时定量、琼脂糖电泳或忍片技术检测转基因成分 是否存在。
[0004] 在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在W下问题中的一种：
[000引转基因成分多种多样，而现有技术一次只能检测其中一种或少数几种，因此，需要 对可能的多种转基因成份逐一进行检测，才能确定为"非转基因"产品；一般检测的是共转 化的转基因成分，而不是外源基因本身，因此，对于无标记转基因来说，采用现有的检测方 法进行检测会失效;检测基本上是定性检测，但定量检测又有其现实需求，例如，相邻田块 的转基因水稻品种的少量花粉被传到了非转基因品种上，在定性检测时，非转基因品种将 被误判为转基因品种而不予审定或进行错误的行政处罚。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种水稻转基因成分的检测方 法。所述技术方案如下：
[0007] 本发明实施例提供了一种水稻转基因成分的检测方法，所述方法包括：
[0008] 确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述 待测样品的外源标准基因，所述待测样品为水稻植株的根、茎、叶、种子和花中的至少一种；
[0009] 制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区 域的多重扩增引物；
[0010] 对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；
[0011] 提取所述混合样品的基因组；
[0012] 向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；
[0013] 利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增 产物构建高通量测序文库；
[0014] 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；
[0015] 分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、 所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；
[0016] 根据所述外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；
[0017] 若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；
[0018] 根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。
[0019] 具体地，所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源 插入旁侧序列中的至少一种。
[0020] 具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。
[0021 ]具体地，所述外源标准基因不存在于所有生物中。
[0022] 具体地，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数 量和所述内源标准基因的测序片段的数量均含α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的 测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败;其中，α1为判 定阔值。
[0023] 具体地，所述判定所述待测样品是否含有转基因成分的方法为：当需要检测的任 意一种所述转基因成分的含量含02时，判定所述待测样品含有转基因成分；当所有所述转 基因成分的含量如2时，判定所述待测样品不含有转基因成分;其中，α2为判定阔值。
[0024] 具体地，计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量的方法为:第m种所述转基 因成分的含量的计算公式为
其中，i为所述第m种转基因成分的 第i个测试区域，nl为所述第m种转基因成分的所述测试区域的个数，bi为所述第m种转基因 成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述 内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源 标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种内源标准基因的第巧巾所述测试区域的所 述测序片段的数量;N为所有所述内源标准基因的所述测试区域的总数。
[0025] 具体地，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于 1/100000。
[0026] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明提供的检测方法可W在 不同待测样品、不同检测的目标基因间通用，可W-次性检测任意多种需要检测的转基因 成分，从而判定待测样品是否含有转基因成分，该方法可W实现定量检测，且检测结果几乎 没有下限，结果准确可靠，是现有技术达不到的。
【具体实施方式】
[0027] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一 步地详细描述。本发明实施例中未注明或详细描述的操作流程或操作规范均为普通分子生 物学技术人员所熟知的操作。本发明实施例中未注明的试剂或生物材料均为市场上销售的 常用试剂或生物材料，均为普通分子生物学技术人员所熟知的，且可W在市场上购买到。 [002引实施例
[0029] 通过农杆菌介导法将双丙氨酷憐抗性(Biolaphos resistance，Ba;r)基因导入日 本晴水稻品种，自交纯化3代后，获得改造的日本晴水稻品种种子，作为本实施例的待测植 物品种。其中，日本晴水稻是标准的转基因水稻受体品种，几乎每个转基因实验室都有日本 晴水稻种子，本实施例中使用的日本晴水稻种子由江汉大学保存和繁殖。
[0030] 水稻品种转基因成分检测方法，具体步骤如下：
[0031] 步骤1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、待测样品中的内源标准基因和待 测样品的外源标准基因，具体方法如下:待测样品为水稻植株的根、茎、叶、种子和花中的至 少一种，具体地，待测样品可W为水稻植株的根、茎、叶、种子和花中的一种，可W为水稻植 株的根、茎、叶、种子和花中巧巾及巧巾W上不同器官的混合物，如叶和茎的混合物。在本实施 例中，待测样品为改造后的日本晴水稻的种子，转基因成分、内源标准基因和外源标准基因 均>1个，转基因成分可W为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧 序列中的至少一种，即通过转基因技术手段向日本晴水稻品种中转入不存在于日本晴水稻 品种中的外源核酸序列；内源标准基因为待测样品的基因组中的单拷贝基因。在本实施例 中，内源标准基因通过NCBKht化://www.ncbi .nlm.nih.gov/)在待测样品基因组上比对时 为单一序列；外源标准基因不存在于所有生物中，在本实施例中，所使用的外源标准基因为 ERCC04基因，其在NCBI上同源比对时，未发现同源序列，可W判定外源标准基因不存在于所 有生物中。在本实施例中，转基因成分共5种，内源标准基因3种，外源标准基因1种，其相关 信息见表1，表1中所列转基因成分不仅包括Bar基因，其为外源功能基因，还包括其他转基 因成分，运些转基因成分在水稻中广泛使用，因此，本实施例提供的检测方法具有通用性。 表1中的基因序列有两种表示方式，一种是直接写出基因序列，另一种是NBCI的基因编号， 表1中的测序区域中的数字代表碱基的位置，该基因的第1个碱基的位置定义为1。
[0032] 表1为实施例一中被检测基因的相关信息与检测结果 [00331
[0034]
[0035]
[0036] 表1中"/"表示无。
[0037] 步骤2、制备用于扩增转基因成分、内源标准基因和外源标准基因的多重扩增引 物，具体方法如下：
[0038] 多重扩增引物的获取过程如下：登录