片段的数量或内源标准基因的测序片段的数量如1时， 则实验失败，实验失败后需要重新进行实验，直至实验成功为止;其中，α1为判定阔值，其大 小依据要求的严格程度和经验人为判定，一般来说，若在高通量测序数据中，可W检测到10 条W上的测序片段，表明所检测的基因是存在的。在本实施例中，α1可W取10条测序片段， 从表1中可W看出，外源标准基因的测序片段的数量和内源标准基因的测序片段的数量均 > 10条，因此证实，本次实验是成功的。
[0053] 步骤10、若实验成功，则计算待测样品种中转基因成分的含量，具体方法如下：
[0054] 第m种转基因成分的含量的计算公式为
其中，i为第m种 转基因成分的第i个测试区域，nl为第m种转基因成分的测试区域的个数，bi为第m种转基因 成分的第i个测试区域的测序片段的数量，k为第k种内源标准基因，n3为内源标准基因的个 数J为第k种内源标准基因的第j个测试区域，n2为第k种内源标准基因的测试区域的个数， aj为第k种内源标准基因的第巧巾测试区域的测序片段的数量;N为所有内源标准基因的测 试区域的总数。
[0055] 从表1可W看出，在本实施例中，共检测了5种转基因成分，所Wm = 5,每一种转基 因成分分别检测了 1个测试区域，所W，nl = l，共检测了3个内源标准基因，所Wn3 = 3,每个 内源标准基因共检测了 1个测试区域，所W，n2 = l，N=3，表l列出了每一种转基因成分与每 一个内源标准基因的测序片段的数量，将它们代入转基因成分的含量的计算公式中可得到 每一种转基因成分的含量，其结果见表1。从表1可W看出，本实施例通过5对多重扩增引物， 一次性地定量检测了5种转基因成分的含量。在本实施例子的基础上，只需要增加更多的多 重扩增引物，即可实现一次定量检测任意多种需要检测的转基因成分的含量。此外，也可W 检测转基因成分、内源标准基因及外源标准基因的多个测试区域，通过平均数消除因不同 基因或不同测试区域的不同扩增效率而造成的测试误差，本实施例由于将每一个检测的基 因的每一个测试区域的扩增效率都控制在了95%-105%之间，误差较小，为节省成本，所W 每一个基因只选择了一个测试区域。
[0056] 步骤11、根据转基因成分的含量判断待测样品中是否含有转基因成分，具体方法 如下：
[0057] 当需要检测的任意一种转基因成分的含量含α2时，则判定待测样品含有转基因成 分；当所有转基因成分的含量<α2时，判定待测样品不含有转基因成分；其中，α2为判定阔 值。
[005引在国标《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》(标准号:GB/T19495.5-2004)中 设定的转基因成份检测下限为0.1%。本实施例中，将02的值设定为0.1%，用于判定待测样 品是否为转基因产品。由于本发明采用测序检测转基因成分，而测序技术得到的是数字信 号，即测到与没有测到两种情况，因此，几乎没有技术下限，与传统的忍片检测技术或实时 定量PCR检测技术比较，没有背景噪音干扰的问题，因此，判定待测样品是否为转基因产品 的判定阔值可W根据具体情况要求的严格程度自由设定。从表1可W看出，本实施例子中，5 种所检测的转基因成分之中，除CrylAc外，其余4种转基因成分的含量均> α2 = 0.1%，因 此，判定本实施例中的待测样品含有转基因成分，该待测样品为转基因植物。
[0059] 结果验证:根据《转基因植物及其产品成分检测Bar基因或pat基因定性PCR方法》 (标准号：农业部1782号公告-6-2012)所提供的方法对待测样品进行了检测，检测结果表明 待测样品含有转基因成分，运与本实施例的结果一致，由此可见，本实施例提供的检测方法 是正确的。
[0060] 本发明提供的检测方法可W在不同待测样品、不同检测的目标基因间通用，能够 同时定量检测待测样品中的任意多种转基因成分，充分满足了转基因检测的现实需求，是 现有技术达不到的。
[0061] W上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种水稻转基因成分的检测方法，其特征在于，所述方法包括： 确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测 样品的外源标准基因，所述待测样品为水稻植株的根、茎、叶、种子和花中的至少一种； 制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的 多重扩增引物； 对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品； 提取所述混合样品的基因组； 向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸； 利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物 构建高通量测序文库； 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组； 分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述 内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量； 根据所述外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功； 若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量； 根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述转基因成分为外源功能基因、抗 性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内源标准基因为所述待测样品的 基因组中的单拷贝基因。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外源标准基因不存在于所有生物 中。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述判断实验是否成功的方法为：当 所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量均含Ol时，贝U 实验成功；当所述外源标准基因的测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量 < a 1时，则实验失败;其中，a 1为判定阔值。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述判定所述待测样品是否含有转基 因成分的方法为：当需要检测的任意一种所述转基因成分的含量含02时，判定所述待测样 品含有转基因成分;当所有所述转基因成分的含量<〇2时，判定所述待测样品不含有转基因 成分;其中，为判定阔值。7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，计算所述待测样品种中所述转基因成 分的含量的方法为:第m种所述转基因成分的含量的计算公式为其中，i为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域，nl为所述第m种转基因成分的所述 测试区域的个数，bi为所述第m种转基因成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数 量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基 因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种 内源标准基因的第巧中所述测试区域的所述测序片段的数量;N为所有所述内源标准基因的
【专利摘要】本发明公开了一种水稻转基因成分的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括：确定转基因成分、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；进行抽样并混合，得到混合样品；提取混合样品的基因组并加入外源标准基因，得到混合核酸；构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；获得待测样品中转基因成分的测序片段的数量、内源标准基因的测序片段的数量和外源标准基因的测序片段的数量；根据外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功并计算待测样品种中转基因成分的含量；根据转基因成分的含量判断待测样品中是否含有转基因成分。该方法能够同时定量检测待测样品中的多种转基因成分。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105586411
【申请号】CN201610060854
【发明人】方治伟, 彭海, 周俊飞
【申请人】江汉大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年1月29日