一株枯草芽孢杆菌、发酵方法、粉剂和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株枯草芽孢杆菌，同时还涉及该枯草芽孢杆菌的发酵方法、含有该 枯草芽孢杆菌的粉剂和应用，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)是一种耐盐、能利用盐碱地和干旱土壤的抗 逆植物，原生长于美国东、南海岸，1992年以后陆续被科学家引入中国。海滨锦葵的种子含 有较高的不饱和脂肪酸和较高的蛋白质，其块根含有多糖、皂苷等成分和抗癌活性成分，能 提高动物的生产性能和免疫力，具有作为饲料、药等的开发潜力。
[0003] 枯草芽孢杆菌是我国允作料添加的两种芽孢杆菌之一，能够产生氨基糖类、磷脂 类、肽类和脂肽类等多种抗生素，已被越来越多的研制成微生物制剂(无毒、无残留、无染色 的添加）。枯草芽孢杆菌具有以下优点：（1)枯草芽孢杆菌具有蛋白、脂肪和淀粉等活性，能 产生抗菌素，其中脂肽类抗生素(包括伊枯草菌素、泛革素和表面活性素)是枯草芽孢杆菌 最重要的抗菌物质。（2)枯草芽孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这些特性对 促进动物营养的消化吸收，提高动物的饲料转化率和疾病防治都有着重要作用，从抗菌机 理上看，既可以干扰病原菌的生物合成系统，也可以对病原菌的细胞壁、细胞膜、核酸和蛋 白质等直接作用，从而达到促进动物生长的目的。（3)枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙 门氏菌都有一定的抑制作用。（4)枯草芽孢杆菌能够通过增强机体的谷胱甘肽过氧化物酶 活性等总抗氧化能力，降低血清及肝脏中丙二醛等氧化终产物的含量，提高畜禽的抗氧化 性能。但是，目前在枯草芽孢杆菌的工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成 本高等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一株枯草芽孢杆菌，同时还涉及该枯草芽孢杆 菌的发酵方法、含有该枯草芽孢杆菌的粉剂和应用，该枯草芽孢杆菌能够提高仔猪的生产 性能和吸收性能，调节猪肠道微生物菌群，该枯草芽孢杆菌的发酵方法简单、活菌数多且芽 孢形成率高。
[0005] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽 孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Baci 1 lus subti 1 is)Gv-l，保藏单位：中国典型培养物保藏中心， 保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号:CCTCC N0:M2015766,保藏日期:2015年12月21日。
[0006] -种枯草芽孢杆菌的发酵方法，将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，恒温振 荡培养，至〇D_达到1.0，得到枯草芽孢杆菌菌液，再将枯草芽孢杆菌菌液以1 %的接种量接 种于发酵培养基，37 °C发酵24-72h。
[0007] 所述发酵培养基的制备方法为:将海冰锦葵块根提取液和普通肉汤培养基按照体 积比4-0.5:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02 %的(NH4)2S〇4和 0.04% 的 NaOH，调节 pH 至 9.0，121°〇高压灭菌3〇111；!_11。
[0008] 所述的海冰锦葵块根提取液的制备方法为:将海滨锦葵块根清洗、干燥并切块，加 水煮沸3次，每次30min，过滤，合并三次煮沸滤液即得;其中，每次加水量为海滨锦葵块根重 量3倍。
[0009] -种含有枯草芽孢杆菌的粉剂，所述的粉剂的制备方法包括以下步骤：
[0010] (1)将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，恒温振荡培养，至OD600达到1.0，得到 枯草芽孢杆菌菌液，再将枯草芽孢杆菌菌液以1 %的接种量接种于发酵培养基，37°C发酵 24-72h；
[0011] (2)将步骤(1)的枯草芽孢杆菌发酵液以12-18%的接种量接种于扩大培养培养基 中，35-39 °C、150-250r/min发酵48h;
[0012] (3)将步骤(2)的发酵液加入自动排渣碟式分离机中离心，得到菌泥，将菌泥和菌 泥载体按照质量比1:2混合，再送入高效沸腾干燥机中烘干，最后用粉碎机粉碎即得。
[0013] 所述发酵培养基的制备方法为:将海冰锦葵块根提取液和普通肉汤培养基按照体 积比4-0.5:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02 %的(NH4)2S〇4和 0 · 04% 的 NaOH，调节 pH至9 · 0，121 °C 高压灭菌 30min;
[0014] 所述的海冰锦葵块根提取液的制备方法为:将海滨锦葵块根清洗、干燥并切块，加 水煮沸3次，每次30min，过滤，合并三次煮沸滤液即得;其中，每次加水量为海滨锦葵块根重 量3倍。
[0015] 所述扩大培养培养基的制备方法为:将海冰锦葵块根提取液、普通肉汤培养基和 玉米粉按照体积比8:1:1的比例混合，得到混合培养液，再加入混合培养液总重量0.02 %的 (順4) 2S〇4和0 · 04 % 的 NaOH，调节pH至9 · 0，121°C 高压灭菌 30min。
[0016] 所述扩大培养培养基中还可加入少许植物油作为消泡剂。
[0017]步骤(3)中发酵液加入自动排渣碟式分离机的流量为400L/h，高效沸腾干燥机的 进风温度为70°C，烘干时间为3h。
[0018] -种含有枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料，所述的猪饲料包括以下重量份的原料:玉 米44份、豆柏45份、麦麸10份、枯草芽孢杆菌粉剂0.01-0.03份、预混料1份;所述的预混料为 每 10千克预混料中含有VA 5512U、VD 640U、VK3 2.2U、VE 20U、VB12 27.6yg、VB2 5.5mg、D-泛酸 14.8mg、烟酸30 · 3mg、胆碱500mg、铜50mg、铁100mg、锌50mg、猛10mg、碘0 · 85mg、硒 0.25mg〇
[0019] -种枯草芽孢杆菌在促进植物生长和提高植物高盐浓度下抗逆性方面的应用。
[0020] -种枯草芽孢杆菌在提高猪生产性能、吸收能力和调节肠道菌群方面的应用。
[0021] 本发明有益效果
[0022] 1、本发明首次从海滨锦葵块根中分离海滨锦葵块根内生菌，并通过纯化，16S rDNA测序以及形态生理特征分析，确定分离培养得到的菌株Gv-Ι为枯草芽孢杆菌。
[0023] 2、本发明的枯草芽孢杆菌Gv-Ι能够促进植物的生长，提高植物高盐浓度下的抗逆 性。
[0024] 3、本发明通过正交实验，优化枯草芽孢杆菌的发酵条件，最终确定在菌液接种量 1%、发酵温度37°C的条件下，发酵培养基中海滨锦葵块根提取液和普通肉汤培养基体积为 4:1，发酵时间72h，活菌数最多，达到1.64 X 109cfu/ml，芽孢率达到99 %。
[0025] 4、本发明通过正交实验，再次优化枯草芽孢杆菌在发酵罐中的发酵工艺条件，最 终确定在发酵时间相同的条件下，菌种接种量15%、发酵温度37°C、培养基pH9.0、转速 250r/min，发酵液中的活菌量最多，达到9.926Log(cfu/mL)。
[0026] 5、本发明利用枯草芽孢杆菌发酵液制备枯草芽孢杆菌粉剂，并添加到猪饲料中， 结果表明，添加了枯草芽孢杆菌粉剂的猪饲料，能够充分发挥枯草芽孢杆菌Gv-1的作用，促 进仔猪的生产性能和对蛋白质、Ca、P的消化吸收，改善仔猪肠道的微生态菌群，使肠道微生 态系统处于最佳的平衡状态。
[0027] 6、本发明方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本发明原 料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。
【附图说明】
[0028] 图1为菌株Gv-1的菌落形态图。
【具体实施方式】
[0029]以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0030] 本发明所用的部分培养基为常见培养基，具体如下：
[0031] PDA平板(PDA固体培养基）：马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮 烂，过滤，滤液加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀， 再补足水分至l〇〇〇mL，121°C高压灭菌20min，铺平板，冷却即可。
[0032]牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-20g，补水至 lL，pH7.4-7.6。
[0033] LB液体培养基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g，补水至lL，pH7.0。
[0034] 实施例1海滨锦葵块根内生菌的分离、纯化、鉴定和保存
[0035] 1、海滨锦葵块根内生菌的分离、纯化
[0036] 海滨锦葵材料取自由美国引进的中国大陆种植的第一年生长的海滨锦葵块根。海 滨锦葵种植试验区位于34° 837 1113° 5(TE，地处河南省郑州市惠济区黄河滩涂。种子种植 的海滨锦葵，在一年生长周期后，冬季进入休眠期，整体取出地下部分块根，作为实验材料。 [0037]将田间新鲜挖去的海滨锦葵块根清洗、通风晾干，无菌条件下使用手术刀片去除 植物表皮。用70 %乙醇浸泡lmin，无菌