水清洗三次，次氯酸钠浸泡2min，70 %乙醇浸泡30s， 最后用无菌水冲洗五次，取最后一次无菌水涂布于PDA培养基上，置于30°C恒温培养。若3-5d内，PDA平板均无任何菌落生成，则表明海滨锦葵块根表面消毒彻底，可以切块培养。若 PDA平板内产生任何菌落，表明海滨锦葵块根表面消毒不彻底，需要进一步消毒。重复以上 步骤，至PDA平板上无菌落生成。用无菌手术刀，将组织切成5mm X 5mm X 5mm见方小块，接种 在PDA平板上，每个TOA平板接种4块海滨锦葵块根切块，共接种10个平板。对照组使用冲洗 小根块的无菌水涂布，所有平板置于30°C的无菌培养箱，培养3-5d。
[0038]将海滨锦葵块根附近不同形态的真菌、细菌接种到新的平板(牛肉膏蛋白胨琼脂 培养基)上，挑去菌丝和菌落时注意不要被其他菌落污染。给新的平板编号，不断挑取不同 形态的菌落转移至新的平板中，至所有平板菌落单一，筛选细菌，最终得到一株菌株Gv-1。 [0039]在15ml试管中加入10ml PDA固体培养基倾斜放置，棉花塞住试管口，接种菌株Gv-1，30°C培养3d后，封口膜封口后保存在4°C环境中。同时，向LB液体培养基中加入30%甘油， 接种筛选出的细菌菌株Gv-1后，加 lml至冻存管中-20°C保存。
[0040] 2、海滨锦葵块根内生菌的鉴定
[0041 ] 2.1菌株Gv-Ι的菌落形态观察
[0042]菌落形态:菌落呈白色或淡黄色、不透明、圆形、表面粗糙，中间有皱起、边缘不整 齐(图1)。
[0043] 生理特征如下表。
[0044]
[0045]
[0046] 2.2细菌基因组DNA的提取
[0047]将保存的细菌菌株分别接种于含有30mL的LB液体培养基的50mL三角瓶中，30°C、 150r/min恒温振荡培养16至18h，至菌液0D6Q()达到1.0。用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒 (生工生物工程有限公司）提取细菌基因组DNA，具体方法如下：
[0048] (1)从每个三角瓶取2ml菌液于离心管中，8000r/min离心lmin，弃上清，收集菌体。 加入180μ1溶菌酶溶液(使用前将相应的溶菌酶加入到Enzymatic lysis Buffer中，配制成 20mg/ml的溶菌酶溶液）重新悬浮菌体，37°C水浴30-60min，之后加入400μ1 Buffer Digestion，震荡混勾。65°C水浴1 h至细胞完全裂解。水浴过程中，每1 Omiη颠倒摇勾一次，促 使样品完全裂解变为澄清透明。
[0049] (2)加入200μ1 Buffer ΡΒ，充分颠倒混匀，-20°C冰箱放置5min。
[0050] (3)室温10，000r/min离心5min，上清液约500_550μ1转移至新的1.5ml离心管中。 若上清液浑浊，可加入等体积氯仿混匀，12，OOOr/min离心取上清。
[0051 ] (4)加入等体积异丙醇，颠倒混匀5到8次，室温放置2-3min。室温10,000r/min离心 5min，弃上清。
[0052] (5)加入lml体积分数75%乙醇，颠倒漂洗1-311^11，10,00(^/1^11离心21^11，弃上清。 注意漂洗时一定使沉淀悬浮起来。
[0053] (6)重复步骤(5)-次。
[0054] (7)开盖室温倒置5-10min，使残留的乙醇挥发完全，避免影响DNA得率和后续实 验。
[0055] (8)得到的DNA沉淀使用50μ1 TE Buffer溶解。TE Buffer为10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH 8.0。
[0056] 所提取的各编号细菌的DNA样本，_20°C保存，备用。
[0057] 2.3PCR 扩增
[0058] 本发明采用细菌 16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID N0.1)和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQIDN0.2)对提取的基因组DNA进行PCR扩 增。50yL PCR反应体系：10XEasyTaq Buffer 5yL，2.5mmol/L dNTP 4yL，Taq酶0.5yL，引物 各lyL，DNA模板2yL，用ddH20定容至50yL。
[0059] PCR反应程序：94°C预变性2min，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸2min，循环 36次，最后72°C延伸保存。
[0060] 2 · 4目的片段的回收和测序
[0061] 2.4.1目的片段的回收
[0062] (1) PCR产物用Gο 1 dv i ew Π 型核酸染色剂染色，2 %琼脂糖凝胶电泳检测。出现 1500bp左右单一目的条带后，将琼脂糖凝胶块切取，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收 目的片段。
[0063] (2)转移琼脂糖凝胶块至分析天平上的1.5mL离心管中。计算凝胶重量，换算该重 量为凝胶体积，l〇〇mg换算为100yL体积（如0.12g凝胶重量，则换算为120yL体积，用于后续 步骤的体积添加）。
[0064] (3)加入3倍琼脂糖凝胶块体积的Buffer DE-A，75°C水浴加热融化，约用时lOmin。
[0065] (4)再加入1.5倍琼脂糖凝胶块体积的Buffer DE-B，充分混合均匀，使混合物颜色 变为黄绿色，充分摇匀，保证形成均一的黄绿色溶液。
[0066] (5)吸取步骤(4)中的黄绿色混合溶液，转移到产品内置的DNA制备管中（2mL体积 的具有过滤网的离心管），12,000倍重力离心lmin，弃掉废液。
[0067] (6)将制备管装回2mL离心管中，加入500yL Buffer W1，12,000倍重力离心30s，弃 掉废液。
[0068] (7)将制备管装回2mL离心管中，加入700yL Buffer W2,12,000倍重力离心30s，弃 掉废液。以同样的方法再次加入700yL Buffer W2,12,000倍重力离心lmin。确认在Buf fer W2中已经加入指定体积的无水乙醇。
[0069] (8)两次使用Buffer W2冲洗能够保证盐分被完全清除，消除对后续实验的影响。 将制备管放回2mL离心管中，12,000倍重力离心111^11。
[0070] (9)将制备管放置于新的洁净1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25yL到30yL的已 加热至65°C的Eluent或者去离子水，室温放置lmin。12,000倍重力离心lmin，洗脱掉制备膜 中央的DNA。
[0071 ] 2.4.2目的片段的连接转化、测序
[0072] 取回收到的目的DNA片段lyL，使用Nano Drop 2000C超微量分光光度计测定DNA浓 度。使用pMD 18-T Vector Kit将目的片段DNA连接至pMD 18-T载体上，将含有目的片段的 载体克隆至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，具体步骤如下：
[0073] (1)在微量离心管中配置如下DNA、载体混合液，全量为5yL。 Γ00741
LUU/s」 u)刀卩入等怀枳byL的Solution 1，16U迕按3(Jmin。目的斤段仕㈨(Jbp以上的UNA 克隆时需要延长至数小时。
[0076] (3)将全量10yL体系加入至100yL的大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰上放置30min。
[0077] (4) 42 °C热激90s后，再次放置在冰上3-5min。
[0078] (5)加入890yL不含有抗生素的S0C或LB培养基，混匀，37°C振荡培养60min，目的是 使菌体复苏。
[0079] (6)向含抗生素的S0C或LB固体培养基上加入40yL X-gal和4yL IPTG备用。
[0080] (7)吸取100_200yL已转化的大肠杆菌DH5a感受态细胞加到步骤(6)的固体培养基 上，均匀的涂开，37°C培养12-16h。
[0081 ] (8)挑取白斑于LB液体培养基中扩大培养，封口摇菌过夜，得到大肠杆菌菌液。以 菌液为模板进行PCR扩增，电泳检测，合格的送到上海生工生物有限公司测序。
[0082] (9)测序结果在BLAST进行相似性的分析。
[0083] 2.4.3BLAST 比对
[0084]将测序公司返回的测序结果进行拼接。由于片段长度为l，500bp，单向测序最多测 序l，000bp，因此采用正反双向测序，分两次将l，500bp的16S rDNA目的序列测通。将正向序 列和反向序列的互补序列使用DNAman及Seqence man软件进行序列拼接，除去中间部分的 重合部分，得到完整的16S rDNA序列。将所得序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)美国国立生物技术信息中心网站（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)上 Basic