基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种酵母菌株，具体地，涉及一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母 菌株及构建方法。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素类材料是一种可持续的能源，能减少人们对石油类燃料的需求，并且 不会与粮食和动物饲料的生产相竞争。木质纤维素类生物质由纤维素、半纤维素和木质素 组成，水解后产生寡糖，主要是葡萄糖和木糖。
[0003] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇生产的常用菌株，具有生物安全性 和较强的乙醇耐受性。目前，天然的酿酒酵母虽然对葡萄糖有着较高的乙醇转化效率，却不 能有效利用木糖，而造成木质纤维素生物质水解后的木糖的浪费。如果能够利用木糖发酵 生产乙醇，能够使得乙醇产量增加25%左右。如何构建能够利用木糖的酿酒酵母菌株，提高 利用木质纤维素类生物质生产乙醇的经济可行性成为有效利用资源的战略问题。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株 及构建方法，该菌株能够有效利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产，提高木 质纤维素生物质的利用率，并且能够进一步提高乙醇的产率。
[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是： 一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae SEB5)，保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 11325。菌株 SEB5即为木糖发酵酵母菌株。
[0007] 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株的构建方法，第一步，将酿酒酵母SEB1和 IR-2分别进行产孢子培养得到SEB1孢子和IR-2孢子，将SEB1孢子和IR-2孢子分别经营养缺 陷型筛选方法得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2和赖氨酸缺陷型的菌株IL-1; SEB1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.11321， IR-2菌株:分离自印度尼西亚发酵食品中，具有乙醇生产能力，有絮凝性，来源记载在下述 文南犬中：Hiroshi K, Yoshio S, Toshio M, Harumi K, Yorikazu S. 1985. Continuous ethanol fermentation with cell recycling using flocculating yeast. J. Ferment. Technol. 63:159-165;该文献翻译后的名称为:使用絮凝性酵母进行带细胞循 环的连续乙醇发酵;上述IR-2生物材料从日本产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST)获得。
[0008] 第二步，菌株SIV-2和菌株IL-1分别经原生质体融合方法、筛选后获得融合子 RHZ-1； 第一步的操作步骤可以为:将SEB1和IR-2分别进行产孢子培养，培养所得的子囊经酵 母裂解酶处理分别得到SEB1孢子和IR-2孢子，将SEB1孢子和IR-2孢子分别经EMS处理，超声 分散后分别涂到YH)平板培养，然后分别影印至最小营养平板，从处理SEB1孢子路线中筛选 得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2,从处理IR-2孢子路线中得到赖氨酸缺陷型的 菌株IL-1，ΥΗ)平板的成分为2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白胨，2%琼脂，最小营养平板的 成分为2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂， 第二步的操作步骤可以为:将菌株SIV-2和菌株IL-1分别经酵母裂解酶处理得原生 质体A和原生质体B，将原生质体A和原生质体B在30%的PEG6000中混匀处理15分钟，涂到再 生平板和选择平板上，在选择平板上生长的菌落筛选获得利用25%糖蜜发酵产乙醇最快和 乙醇浓度最高的融合子RHZ-1，选择平板的成分为2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼 月旨，再生平板的成分为2%葡萄糖，0.5%酵母粉，1%多聚蛋白胨，4.5%氯化钾，2%琼脂； 第三步，将融合子RHZ-1经紫外诱变涂至含尿嘧啶的5-FOA平板，获得尿嘧啶缺陷型的 菌株1; 第四步，使用引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株1的基因组DNA中PCR扩增获得TRP1基因 的上游片段347 bp，使用引物TRP1PTEF1-F和ERG25 rev从质粒PET01中PCR扩增获得2060 bp的 Ptefi_ERG25片段，使用引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中PCR扩增获 得1137 bp的URA3片段，将得到的PTEF1-ERG25片段和URA3片段通过融合PCR获得3504 bp的 DNA 片段 Ptefi-ERG25-URA3 ; 其中引物TRP1-437F的基因序列如SEQ ID N0:1，TRP1-93R的基因序列如SEQ ID NO:2， TRP1PTEF1-F的基因序列如SEQ ID NO:3，ERG25 rev的基因序列如SEQ ID N0:4，ERG-TRP1URA3的基因序列如SEQ ID N0:5，TRP1URA3R_2的基因序列如SEQ ID NO:6; 第五步，将200 ng DNA片段Ptefi-ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因的上游片段内 部，在MM(-Umix)平板上筛选，得到菌株2; 第六步，将菌株2涂至5-FOA平板，得到敲除了 URA3标记的菌株3; 第七步，使菌株3在产孢子培养基上生长一周形成孢子，将孢子洗涤后再经酵母裂解酶 和超声处理涂至酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，获得纯合子双倍体的单菌落，将单菌落在MM (-Tmix)平板上筛选，获得不能在该平板上生长的色氨酸缺陷型的菌株4; 第八步，将质粒PRS404和质粒pBlue-BGLlc分别由内切酶Notl酶切后连接得到质粒 pIWBGLU参见附录文献2)，，用内切酶SspI在菌株4的PTDH3内部酶切后，将质粒pIWBGLl(参 见附录文献2)用醋酸锂法导入菌株4的P TDH3区域，以不含色氨酸的平板筛选转化子，进行 PCR确认后，获得菌株5;将内切酶PstI在菌株5的URA3内部酶切后，将质粒PIUX1X2XK(参见 附录文献3)用醋酸锂法导入菌株5的URA3区域，以不含尿嘧啶的平板筛选转化子，进行PCR 确认后，获得菌株6。
[0009]第九步，菌株6在产孢子培养基上培养分离单孢子后得到纯合子菌株7;将纯合子 菌体在以木糖作为唯一碳源的培养基中进行驯化，驯化过程将经活化离心分散处理的菌株 7分别接种到2%YPX和2%YNBX两种培养基中连续培养传代，起始0D 66Q为0.1，培养温度为35 °C，转速为200 rmp，2%YPX组成：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和20 g/L木糖；2%YNBX组成： 6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、20 g/L木糖，每隔10代保存驯化过程中的菌体，分别得到2%YPX 培养体系过程中的第11代、第19代和第24代群落￥?乂-11、￥?乂-19、￥?乂24，以及2%￥呢乂的第10 代和第26代群落ΥΝΒ10和ΥΝΒ26; 第十步，稀释驯化得到的YPX-11、YPX-24和YNB-26菌体，并将其涂布至2%YPX或2%YNBX 平板上，30° C培养形成单菌落，挑取大的单菌落和菌株7进行批次发酵比较，即接种至2%YPX 或2%ΥΝΒΧ培养基中，筛选出乙醇产量高的菌株，再将乙醇产量高的菌株们和菌株7再次进行 批次发酵比较，接种至4% ΥΡΧ培养基中发酵，筛选获得乙醇产量高的菌株SEB5，即木糖发酵 酵母菌株。
[0010]菌株7的活化离心分散处理具体为在YPD平板上活化菌株7,培养温度为30°C，时间 为24 h;然后接种到5%ΥΗ)液体培养基中预培养16 h，培养温度为35°C;9000 g离心3 min收 集菌株7的菌体，用灭菌水洗涤；用0.0 5mM EDTA分散菌体，其中5%YPD组成：20 g/L蛋白 胨、10 g/L酵母粉和50 g/L葡萄糖。
[0011] 第十步中挑取大的单菌落和菌株7进行批次发酵具体为:将大的单菌落及菌株7分 别经过活化离心分散处理收集菌体后，以起始〇D 66Q为0.1接种至2%YPX或2%YNBX培养基中发 酵24或48 h。活化离心分散处理方法如上述的菌株7的活化离心分散处理方法。
[0012] 第十步中乙醇产量高的菌株们和菌株7再次进行批次发酵具体为:将乙醇产量高 的菌株们和菌株7分别经过活化离心分散处理收集菌体后，以起始0D 66Q为0.1接种至4%YPX 培养基中发酵48 h。活化离心分散处理方法如上述的菌株7的活化离心分散处理方法。
[0013] 菌株2、菌株3和菌株4均需使用引物TRP1-437F和TRP1+717R进行PCR验证，其中 TRP1+717R的基因序列如SEQ ID N0:7。
[0014] 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae SEB5)在利 用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产的应用。
[0015] 综上，本发明的有益效果是： 本发明获得的木糖发酵酵母菌株能够有效利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙 醇的生广，提尚木质纤维素生物质的利用率，并且能够进一步提尚乙醇的广率，在48小时发 酵时间内，木糖发酵酵母菌株SEB5产乙醇最高可达12.91 g/L，木糖利用率达到了0.952 g/ L/h〇
[0016] 本发明中涉及保藏的微生物的保藏信息如下： 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;地址:北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年9月6日；保藏编号： CGMCC11321、CGMCC11325;分类命名：Saccharomyces cerevisiae〇
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1为菌株7和驯化所得菌体的发酵性能比较； 图2为菌株7驯化前后菌株的发酵性能比较。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，