cttaaaaactacatatacaaaaactacaaa aatctttcaaccgacccatcttctggcagatctgaataatctaatccatggaccgtatccaccccactcttcgtatt tgccctctggataccaggaattggcctccaatctgcaaactctttcaggatgtggcatcatggcaagcactctacca tttggtgacttgataccggcaataccattggtcgacccattggggttgaaggggaacctttcggtgacgttaccgta gttttgatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaagagattcggtaatctccgagcagaaggaagaacgaa ggaaggagcacagacttagattggtatatatacgcatatgtggtgttgaagaaacatgaaattgcccagtattctta acccaactgcacagaacaaaaacctgcaggaaacgaagataaatcatgtcgaaagctacatataaggaacgtgctgc tactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattgg atgttcgtaccaccaaggaattactggagttagttgaagcattaggtcccaaaatttgtttactaaaaacacatgtg gatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgctaaaggcattatccgccaagtacaattttttact cttcgaagacagaaaatttgctgacattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcag aatgggcagacattacgaatgcacacggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcggaagaa gtaacaaaggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgtcatgcaagggctccctagctactggagaatatac taagggtactgttgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggctttattgctcaaagagacatgggtggaa gagatgaaggttacgattggttgattatgacacccggtgtgggtttagatgacaagggagacgcattgggtcaacag tatagaaccgtggatgatgtggtctctacaggatctgacattattattgttggaagaggactatttgcaaagggaag ggatgctaaggtagagggtgaacgttacagaaaagcaggctgggaagcatatttgagaagatgcggccagcaaaact aaaaaactgtattataagtaaatgcatgtatactaaactcacaaattagagcttcaatttaattatatcagttatta cccaatgttggtgatgcgcttagattaaatggcgttattggtg
【主权项】
1. 一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae SEB5)， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 11325。2. 如权利要求1所述的基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株的构建方法，其特征在 于，包括以下步骤： 第一步，将酿酒酵母SEB1和IR-2分别进行产孢子培养得到SEB1孢子和IR-2孢子，将 SEB1孢子和IR-2孢子分别经营养缺陷型筛选方法得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株 SIV-2和赖氨酸缺陷型的菌株IL-1，SEB1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏号为CGMCC N0.11321; 第二步，菌株SIV-2和菌株IL-1分别经原生质体融合方法、筛选后获得融合子RHZ-1; 第三步，将融合子RHZ-1经紫外诱变涂至含尿嘧啶的5-F0A平板，获得尿嘧啶缺陷型的 菌株1; 第四步，使用引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株1的基因组DNA中PCR扩增获得TRP1基因 的上游片段347 bp，使用引物TRP1PTEF1-F和ERG25 rev从质粒PET01中PCR扩增获得2060 bp的 Ptefi_ERG25片段，使用引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中PCR扩增获 得1137 bp的URA3片段，将得到的PTEF1-ERG25片段和URA3片段通过融合PCR获得3504 bp的 DNA 片段 Ptefi-ERG25-URA3 ; 其中引物TRP1-437F的基因序列如SEQ ID N0:1，TRP1-93R的基因序列如SEQ ID NO: 2，TRP1PTEF1-F的基因序列如SEQ ID N0:3，ERG25 rev的基因序列如SEQ ID N0:4，ERG-TRP1URA3的基因序列如SEQ ID N0:5，TRP1URA3R_2的基因序列如SEQ ID N0:6; 第五步，将200 ng DNA片段PTEF1-ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因的上游片段内部， 在MM(-Umix)平板上筛选，得到菌株2; 第六步，将菌株2涂至5-F0A平板，得到敲除了 URA3标记的菌株3; 第七步，使菌株3在产孢子培养基上生长一周形成孢子，将孢子洗涤后再经酵母裂解酶 和超声处理，涂至酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，获得纯合子双倍体的单菌落，将单菌落在MM (-Tmix)平板上筛选，获得不能在该平板上生长的色氨酸缺陷型的菌株4; 第八步，将质粒PRS404和质粒pBlue-BGLlc分别由内切酶Notl酶切后连接得到质粒 pIWBGLl，用内切酶SspI在菌株4的PTDH3内部酶切后，将质粒pIWBGLl用醋酸锂法导入菌株4 的Ptdh3区域，以不含色氨酸的平板筛选转化子，用引物BGL1-27F，AGG215F，BGL1-1503R进 行PCR确认后，获得菌株5;将内切酶PstI在菌株5的URA3内部酶切后，将质粒PIUX1X2XK用醋 酸锂法导入菌株5的URA3区域，以不含尿嘧啶的平板筛选转化子，进行PCR确认后，获得菌株 6； 第九步，菌株6在产孢子培养基上培养分离单孢子后得到纯合子菌株7 ;将纯合子菌株 在以木糖作为唯一碳源的培养基中进行驯化，驯化过程是将经活化离心分散的菌株7分别 接种到2%YPX和2%YNBX两种培养基中，反复传代培养，起始0D 66Q为0.1，培养温度为35°C，转 速为200 rmp，2%YPX组成:20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和20 g/L木糖;2%YNBX组成:6.7 g/ L无氨基酸酵母氮源、20 g/L木糖，每隔10代保存驯化过程中的菌体，分别得到2%YPX培养体 系过程中的第11代、第19代和第24代群落￥?乂-11、￥?乂-19、￥?乂24，以及2%￥他乂的第10代和第 26 代群落 ΥΝΒ10 和 ΥΝΒ26; 第十步，稀释驯化得到的ΥΡΧ-11、ΥΡΧ-24和ΥΝΒ-26菌体，并将其涂布至2%ΥΡΧ或2%ΥΝΒΧ 平板上，30°C培养形成单菌落，挑取大的单菌落和菌株7接种至2%YPX或2%YNBX培养基中进 行批次发酵比较，筛选出乙醇产量高的各突变菌株，再将乙醇产量高的各突变菌株和菌株7 再次接种至4% YPX培养基中进行批次发酵比较，得到乙醇产量高的突变菌株SEB5。3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，菌株7的活化离心分散处理具体为:在 YH)平板上活化菌株7，培养温度为30°C，时间为24 h;然后接种到5%ΥΗ)液体培养基中预培 养16 h，培养温度为35°C;9000 g离心3 min收集菌株7菌体，用灭菌水洗涤；用0.05 mM Η)ΤΑ分散菌体，其中5%ΥΗ)组成:20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和50 g/L葡萄糖。4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，第十步中挑取大的单菌落和菌株7进 行批次发酵具体为:将大的单菌落及菌株7分别经过活化离心分散处理收集菌体后，以起始 OD66q为0.1接种至2%YPX或2%YNBX培养基中发酵24或48 h。5. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，第十步中乙醇产量高的菌株们和菌株 7再次进行批次发酵具体为:将乙醇产量高的菌株们和菌株7分别经过活化离心分散处理收 集菌体后，以起始〇D 66Q为0.1接种至4%YPX培养基中发酵48 h。6. 如权利要求1所述的基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae SEB5)在利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法，该构建方法包括获得融合子，得到DNA片段<i>PTEF1-ERG25-URA3</i>，将DNA片段<i>PTEF1-ERG25-URA3</i>导入到菌株1的<i>TRP1</i>基因的上游片段内部，在MM(-Umix)平板上筛选得到菌株2；得到敲除了<i>URA3</i>标记的菌株3；再获得色氨酸缺陷型菌株4；最后质粒酶切后导入菌株5，再平板筛选转化子获得菌株6，再将菌株7进行驯化筛单菌后得到菌株SEB5。该方法获得的木糖发酵酵母菌株能够有效利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产，提高木质纤维素生物质的利用率，并且能够进一步提高乙醇的产率。CGMCC No.1132120150906
【IPC分类】C12N1/19, C12P7/10, C12N15/04, C12R1/865, C12N13/00
【公开号】CN105624051
【申请号】CN201610048099
【发明人】汤岳琴, 曾维怡, 苟敏, 孙照勇, 木田建次, 夏子渊
【申请人】四川大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月26日