单管中多重靶核酸的实时荧光pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测技术领域，涉及在单个PCR反应容器中多重检测样品中靶核 酸的PCR方法，具体涉及一种单管中多重靶核酸的实时荧光检测PCR方法以及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 自1971年开始HBsAg作为常规筛查项目引入到血液筛查，使得输血后感染乙肝的 发生率大大降低，但每年仍有少量新发输血后肝炎病例报道。例如美国无偿献血者每单位 供血传播HBV的危险性为1/6.3万。这些危险主要来自HBV"窗口期"、病毒变异、低病毒载量 感染等。间接酶联免疫法(ELISA)筛查并不能从根本上排除病毒存在的危险，由于HBV感染 后病毒颗粒先于HBsAg释放到血液中，在约50天的"窗□期"内，感染者的HBsAg检测呈阴性， 但是其血液却具传染性。而使用核酸检测(Nucleic acid test，NAT)技术能提前20天筛查 出HBsAg阴性、HBV-DNA阳性献血者。
[0003] 随着血液制品在世界范围的流通，HCV感染呈世界性分布，为了控制丙型肝炎病毒 的血液传播，世界各国均开展了对献血员抗-HCV的检测。常用的抗-HCV诊断试剂采用间接 酶联免疫法(ELISA)，第一代抗-HCV ELISA采用的抗原C100-3是HCV非结构基因（NS3/NS4) 和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的融合蛋白，灵敏度低，漏检率较高；第二代抗-HCV ELI SA在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c，虽然在灵敏度和 特异性上有很大改善，但仍不能排除由于重组融合蛋白带来的少数假阳性和极少数的漏 检。目前我国多采用第三代抗-HCV ELISA试剂，其包被抗原为HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5 抗原，特异性超过99%，虽然目前缺乏判断其敏感性的金标准，但对于免疫功能正常的HCV-RNA阳性感染者，抗-HCV检出率也高于99% ACV感染后一般到抗体转阳有一个较长的窗口 期，平均为70天，有的患者窗口期可延长至6-9月或更长，约1%-3%的患者抗-HCV可持续阴 性，而基因组的复制出现得很早，感染后数天即出现病毒血症。已有输血后即有丙型肝炎病 毒感染发生的报道，这表明抗-HCV阴性的献血员中有少数存在丙型肝炎病毒输血传播的可 能性。
[0004] 人类获得性免疫缺陷综合症简称艾滋病，是由一种存在于血液中并攻击免疫系统 的病毒引起的。据WHO估计，我国艾滋病感染人数到2010年将达到1000万，并持续高速增长。 血液传播是艾滋病毒传播的重要途径之一。全球每年增加560万艾滋病毒携带者，有5%至 10%的人是经过输血或血液制品而感染的。
[0005] 根据所采用的检测方法的灵敏度不同，感染窗口期的长短不同。采用核酸测定方 法，HIV的感染窗口期为11天;采用第3代EIA试剂盒，HIV的感染窗口期为22天;采用第4代 EIA试剂盒，HIV的感染窗口期为18天。由于空白窗口期的存在，即使未来技术的灵敏度足以 消除感染窗口期，仍然无法将HIV感染的窗口期缩短为零。
[0006] 目前，在临床上筛选各种血源性传播疾病的方法，主要是免疫学诊断方法。尽管随 着第三代单克隆诊断抗体的出现，在很大程度上增加了筛查和检测的灵敏度，并在一定程 度上减少了血源传播病毒性疾病的概率。但由于受免疫学诊断方法的灵敏度及其与生倶来 的限制，依然不能完全杜绝阳性病毒血样的漏检，漏检率较高。其主要原因在于，免疫学诊 断主要依赖抗原抗体介导的免疫反应，而病毒感染机体后，机体产生可检测水平的高滴度 抗体的需要一段相对较长的时间。另外，由于个体免疫机能不同，其中有少数感染者感染后 机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测线一下，甚至不产生抗体。因此，免疫学诊断 方法不能检测出处于窗口期和新近感染病毒的献血员，这样势必导致漏检。其次，抗原出现 变异以及稀有亚型也可导致漏检，因此，免疫学筛查后，输血相关疾病传播依然存在一定的 概率。
[0007] 目前免疫学检测以上三种病毒的平均窗口期分别为:HBV56天，HCV70天，HIV22天。 近5年来，随着以核酸检测(Nucleic acid test，NAT)为代表的分子生物学技术在血液筛查 方面的应用，输血及血制品安全性有了很大的提高。在理论上，NAT技术能够显著的缩短病 原体检出的窗口期。另外，NAT技术灵敏度和特异性均较显著的高于免疫学方法。核酸检测 HBV，HCV，HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前:9天、25天、14天。而应用NAT技术筛查献血 员，相应的可将献血员传播以上病毒性疾病的概率分别降低42%、72%和50%。
[0008] 但是现有的核酸检测技术具有以下缺点：（1)以诺华诊断的TMA方法以及罗氏诊断 等采用单管检测，但是不能区分HBV，HCV及HIV-1病毒种类，根据中国国情，如血液中心检测 到HIV-1反应性样本，需报当地疾病预防控制中心做确诊检测，因此血液中心还需要采购这 些厂家的病毒种类检测试剂，增加了成本；
[0009] (2)以达安基因，科华生物为代表的采用三管检测技术，会限制检测通量。例如，同 样采用96孔的PCR仪器，科华需要三个孔才能检测一个样本，整机不计算对照样品最多检测 32个样本，试剂整体的成本也较高;另外核酸提取模板要分成三份分别检测，试剂灵敏度受 影响较大，尤其是针对隐匿性乙肝造成潜在漏检风险。
【发明内容】
[0010] 为了解决以上技术问题，本发明实施例中提供了一种单管中多重靶核酸的实时荧 光检测PCR方法，每种病毒靶核酸分别是HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA，其包括如下步骤：
[0011] (1)在单个PCR反应管中混合样本核酸，Tth DNA聚合酶，H-Taq DNA聚合酶，Μη (OAc) 2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探针，以及内标探 针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团 的检测波长不同；其中，
[0012] 所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQ ID NO: 1
[0013] 5 '-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3 '；
[0014] 所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为：SEQ ID N0:2
[0015] 5 '-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3 '；
[0016] 所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:3
[0017] 5，-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3，；
[0018] 所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:4
[0019] 5 '-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3 '；
[0020] 所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:5
[0021 ] 5 '-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3 '；
[0022] 所述HCV-RNA探针的碱基序列为:SEQ ID N0:6
[0023] 5，-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3，；
[0024] 所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:7
[0025] 5 '-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3 '；
[0026] 所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:8
[0027] 5 '-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3 '；
[0028] 所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:9
[0029] 5 '-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3 '；
[0030] 所述内标探针的碱基序列为:SEQ ID NO: 10
[0031] 5 '-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3 '；
[0032] 所述内标的扩增子序列的碱基序列为:SEQ ID NO: 11
[0033] 5 '-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCC AAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3,；
[0034] (2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；
[0035] (3)选择?六1通道检测!11￥-11?祖，1?(?通道检测!1(^-1?熟阳性样本，0￥5通道检测冊￥-DNA;根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有HBV-DNA，HCV-RNA和HI V-1-RNA中的一种 或几种病毒靶核酸存在于样品。
[0036]优选的，上述的方法，其中，所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV-1-RNA 的上下游引物。
[0037] 优选的，上述的方法，其中，所述内标包含在人造病毒颗粒内。
[0038] 优选的，上述的方法，其中，所述各种探针标记有不同的荧光基团。
[0039] 优选的，上述的方法，其中，所述PCR反应条件为：（1)预变性和酶激活，95°C，1分 钟，循环数为1;(2)逆转录，60°C，30分钟，循环数为l;(3)cDNA预变性，95°C，1分钟，循环数 为1; (4)变性，退火，延伸及荧光采集，循环数为45,其中变性95°C，15秒;退火，延伸及荧光 采集，60 °C，30秒；（5)仪器冷却，25 °C，10秒，循环数为1。
[0040] 优选