的，上述的方法，其中，所述步骤(3)中所述根据荧光检测结果计算出的Ct值 判断:FAM通道测定Ct值<45的样本为HIV阳性样本，R0X通道测定Ct值<45的样本为HCV阳 性样本，CY5通道测定Ct值< 45的样本为HBV阳性样本。
[0041 ] 一种单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测试剂盒，其包括Tth DNA聚合酶，H-Taq DNA聚合酶，Mn(0Ac)2，dNTPs，内标，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的引物对和探针，以及 内标探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且各种探针标记的荧 光基团的检测波长不同；其中，
[0042] 所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQ ID N0:1
[0043] 5 '-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3 '；
[0044] 所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:2
[0045] 5，-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3，；
[0046] 所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:3
[0047] 5 '-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3 '；
[0048] 所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:4
[0049] 5 '-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3 '；
[0050] 所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:5 [0051 ] 5 '-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3 '；
[0052] 所述HCV-RNA探针的碱基序列为:SEQ ID NO:6
[0053] 5，-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3，；
[0054] 所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:7
[0055] 5 '-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3 '；
[0056] 所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:8
[0057] 5 '-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3 '；
[0058] 所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:9
[0059] 5 '-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3 '；
[0060] 所述内标探针的碱基序列为:SEQ ID NO: 10
[0061 ] 5 '-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3 '；
[0062] 所述内标的扩增子序列的碱基序列为:SEQ ID NO: 11
[0063] 5 '-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCC AAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3, 。
[0064] 优选的，上述的试剂盒，其中，所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述HIV-1-RNA的上下游引物。
[0065] 优选的，上述的试剂盒，其中，所述内标核酸被包装在病毒样颗粒内。
[0066] 在本发明中，"多重检测"指的是同时检测的核酸有多种，即至少两种，由于至少检 测了内标核酸和一种靶核酸，因此检测的核酸至少有两种。当要检测的靶核酸种类不止一 种时，和/或作为内对照的内对照核酸种类不止一种时，则同时检测的核酸相应增加。其中， 每种核酸可以是RNA，也可以是DNA。多种靶核酸中有RNA靶核酸，也有DNA靶核酸。
[0067] 优选在本发明的方法中，在步骤（1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有 PCR反应所需的其他试剂，如5 XPCR buffer。在本发明的【具体实施方式】中，5 XPCR buffer 由0.25mol/L的N，N-二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾(Bicine/K0H)，pH 8.2;575mmol/L的乙酸钾 (Potassium acetate)和40% (v/v)甘油（glycerol)组成。
[0068] 在本发明的方法中，不同种探针之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相 同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变 化，从而能够进行同时检测。在每种探针的碱基序列的5 '端标记荧光基团，3 '端标记淬灭基 团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。
[0069] 本领域技术人员能够根据引物及相应需要PCR扩增的核酸来设计PCR反应条件。对 于多重检测，为了平衡不同种核酸的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件如表 1所示。
[0070] 表 1
[0071]
[0072] 在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪 所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果 的优良指标。选择FAM通道检测HI V-1RNA，R0X通道检测HCV-RNA，CY5通道检测HBV-DNA; FAM 通道测定Ct值<45的样本为HIV阳性样本，R0X通道测定Ct值<45的样本为HCV阳性样本， CY5通道测定Ct值<45的样本为HBV阳性样本。
[0073] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0074]采用单管技术可以从根本上解决目前单管检测不能区分HBV，HCV及HIV-1病毒种 类的技术问题;血液中心不需要采购厂家的病毒种类检测试剂，降低了成本;解决了三管检 测技术，限制检测通量的问题，使得试剂灵敏度提高，并且降低隐匿性乙肝潜在漏检风险； 同时降低成本，提高仪器使用率，满足血液中心检测要求。
【具体实施方式】
[0075]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0076] 实施例
[0077] 本实施例提供的一种单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测试剂盒，其包括Tth DNA聚合酶，H-Taq DNA聚合酶，Μη (OAc) 2，dNTP s，内标，HB V-DNA、HCV-RNA 以及ΗIV-1-RNA 的 引物对和探针，以及内标探针，针对所述的各种探针标记有荧光基团和荧光淬灭基团，而且 各种探针标记的焚光基团的检测波长不同；其中，
[0078] 所述HBV-DNA上游引物的碱基序列为：SEQ ID Ν0:1
[0079] 5 '-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3 '；
[0080] 所述HBV-DNA下游引物的碱基序列为：SEQ ID N0:2 [0081 ] 5 '-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3 '；
[0082] 所述HBV-DNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:3
[0083] 5，-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3,；
[0084] 所述HCV-RNA上游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:4
[0085] 5 '-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3 '；
[0086] 所述HCV-RNA下游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:5
[0087] 5 '-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3 '；
[0088] 所述HCV-RNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:6
[0089] 5，-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3,；
[0090] 所述HIV-1-RNA上游引物的碱基序列为:SEQ ID N0:7
[0091 ] 5 '-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3 '；
[0092] 所述HIV-1-RNA下游引物的碱基序列为：SEQ ID N0:8
[0093] 5 '-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3 '；
[0094] 所述HIV-1-RNA探针的碱基序列为：SEQ ID NO:9
[0095] 5 '-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3 '；
[0096] 所述内标探针的碱基序列为:SEQ ID NO: 10
[0097] 5 '-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3 '；
[0098] 所述内标的扩增子序列的碱基序列为:SEQ ID NO: 11
[0099] 5 '-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCC AAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3, 。
[0100] 所述内标是竞争性内标，其与HIV共用所述Η?ν-1-RNA的上下游引物;所述内标核 酸被包装在病毒样颗粒内。
[0101] 此外，本试剂盒含包括单个PCR反应容器中还进一步混合有PCR反应所需的其他试 剂，如5\?0?131^€66其中5\?0?131^€61由0.25111〇1/1的叱1二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾 (Bicine/KOH) ,ρΗ 8.2； 575mmol/L 的乙酸钾（Potassium acetate)和40% (v/v)甘油 (g