胰岛素类似物的新衍生物的制作方法
【专利说明】胰岛素类似物的新衍生物 发明领域
[0001] 本发明提供人胰岛素的类似物的新衍生物，其可用于治疗糖尿病。
[0002] 发明背景 胰岛素是由胰腺的细胞分泌的多肽激素。胰岛素由称为A链和B链的两条多肽链组 成，A链和B链通过两个链间二硫桥连接在一起。在人、猪和牛胰岛素中，A链和B链分别包含 21和30个氨基酸残基。然而，在不同物种之间在两条链的不同位置上存在的氨基酸残基中 存在变化。基因工程改造的广泛使用使得通过交换、缺失和添加一个或多个氨基酸残基来 制备天然存在的胰岛素的类似物成为可能。胰岛素可用于治疗糖尿病和与其关联或自其产 生的疾病。
[0003] 几十年以来，已经开发了具有不同的作用持续时间的胰岛素制剂并投入市场，这 样的制剂的一般性实例是长效胰岛素制剂、中效胰岛素制剂和速效胰岛素制剂。许多患者 每天接受2-4次注射，每周，每月和每年，任选数十年都是如此。迄今为止，无基础胰岛素产 品已获得批准用于比每日皮下注射更低频率地给予。大量每日注射的不适可例如通过使用 具有极度长的作用持续时间的胰岛素衍生物来减少。
[0004] 包括W0 2010/049488和W0 2011/161125在内的多个专利申请提及以长时间间隔 给予胰岛素衍生物的可能性。W0 2009/115469涉及某些酰化蛋白酶稳定的胰岛素，其中至 少一个疏水氨基酸已被亲水氨基酸置换。
[0005] 如果可获得大致每周一次给予的基础胰岛素制剂，则对于糖尿病患者会是非常合 乎需要的。
[0006] 发明目标 本发明的目标是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代品。
[0007] 本发明的另一方面涉及提供具有长的药代动力学（下文称为PK)特征的胰岛素衍 生物，例如使得一周一次或更低频率的皮下治疗将为糖尿病患者对基础胰岛素治疗的需要 的令人满意的治疗。
[0008] 本发明的另一方面涉及提供在皮下给予后具有长的PK特征(例如比人胰岛素的PK 特征更长的PK特征)的胰岛素衍生物。在该方面，PK特征可按本文实施例5和6中所述进行测 定。
[0009] 本发明的另一方面涉及提供在水性介质(任选包含锌）中具有高的溶解度(例如比 人胰岛素的溶解度更高的溶解度）的胰岛素衍生物。在该方面，溶解度可按本文实施例7中 所述进行测定。
[0010] 本发明的另一方面涉及提供当在制备后在等于或低于37°C下贮存至少4个周后测 量时，在包含锌例如至少5个锌离子/胰岛素六聚体的水性介质中可溶的胰岛素衍生物。在 该方面，溶解度可例如按本文实施例7中所述进行测定。
[0011] 本发明的另一方面涉及提供当在制备后在24-48小时内测量时在包含锌例如至少 5个锌离子/胰岛素六聚体的水性介质中可溶的胰岛素衍生物。在该方面，溶解度可按本文 实施例7中所述进行测定。
[0012] 本发明的另一方面涉及提供具有良好的对抗酶的稳定性的胰岛素衍生物，所述酶 例如蛋白水解酶，例如在人胃中存在的蛋白水解酶，例如胃蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶A。在 该方面，对抗酶的稳定性可按W0 2008/034881的实施例1中所述进行测定。
[0013] 本发明的另一方面涉及提供在贮存时具有良好的稳定性、特别是化学稳定性和物 理稳定性的胰岛素衍生物，所述贮存例如在5°C和在30°C下分别贮存例如2年和2周。在该方 面，化学稳定性可按本文实施例9和10中所述进行测定，和物理稳定性可按本文实施例9和 10中所述进行测定。
[0014] 本发明的另一方面涉及提供可有效地例如每天一次口服给予糖尿病患者的胰岛 素衍生物。另外或备选地，本发明涉及提供具有高的口服生物利用度的胰岛素衍生物。
[0015] 本发明的另一方面涉及提供在例如每周一次皮下给予后具有减少的每日波动，例 如在血浆浓度(Cmax和C min)之间的变化的胰岛素衍生物。
[0016] 本发明的另一方面涉及提供在口服给予后具有减少的对每日生物利用度变化的 影响的胰岛素衍生物。
[0017] 本发明的另一方面涉及提供具有高效力，即在低药物浓度下引起大反应的胰岛素 衍生物(药物活性根据产生给定强度的效果所需要的量来表示）。
[0018] 本发明的另一方面涉及提供极好地结合胰岛素受体的胰岛素衍生物。在该方面， 胰岛素受体亲和力可按本文实施例2中所述进行测定。
[0019] 本发明的另一方面涉及提供具有低的胰岛素受体亲和力的胰岛素衍生物。在该方 面，胰岛素受体亲和力可按本文实施例2中所述进行测定。
[0020] 定义 术语"糖尿病"包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病(在妊娠期间）和引起高血糖症 的其它状态。该术语用于代谢紊乱，其中胰腺产生不足量的胰岛素，或其中身体的细胞不能 适当地响应胰岛素，从而阻止细胞吸收葡萄糖。结果，葡萄糖在血液中聚集。
[0021] 1型糖尿病，亦称为胰岛素依赖性糖尿病（IDDM)和青少年型糖尿病，由B-细胞破坏 引起，通常导致绝对胰岛素缺乏。2型糖尿病，亦称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)和成年 型糖尿病，与主要的胰岛素抵抗和由此相对胰岛素缺乏和/或具有胰岛素抵抗的主要胰岛 素分泌缺陷有关。
[0022] 在本文中，胰岛素的命名按照以下原则进行:按相对于人胰岛素的突变和修饰(酰 化)给予名称。对于酰基部分的命名，按照IUPAC命名法和在其它情况下按肽命名法进行命 名。例如，命名酰基部分：
可例如命名为"二十烷二酰基-γ G1U-0EG-0EG"、"二十烷二酰基-γ Glu-2x0EG"或"二 十烷二酰基-gGlu-2x0EG"或"19-羧基十九烷酰基-γ Glu-〇EG-〇EG"，其中0EG是氨基酸NH2 (CH2)20(CH2)2〇CH2C0 2H([2-(2-氨基乙氧基）乙氧基]乙酸）的简写表示，yGlu (以及gGlu) 是呈L构型的氨基酸γ谷氨酸的简写表示。或者，酰基部分可按照IUPAC命名法(OpenEye， IUPAC格式)命名。根据该命名法，本发明的上述酰基部分被称为以下名称：[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-氨基]-乙氧基]-乙氧基]乙 酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]。
[0023]例如，实施例1的胰岛素(具有下文给出的序列/结构)被称为"A14E，B16E，B25H， Β29Κ(Νε二十烷二酰基-gGlu-2x0EG)，desB30人胰岛素"，以表示人胰岛素中位置A14的氨 基酸Y已被突变为E，人胰岛素中位置B16的氨基酸Y已被突变为E，人胰岛素中位置B25的氨 基酸F已被突变为H，人胰岛素中位置B29的氨基酸K已通过在B29的赖氨酸残基的ε氮(称为N ε)上被残基二十烷二酰基-gGlu-2x0EG酰化而修饰，和人胰岛素中位置Β30的氨基酸Τ已被 缺失。
[0024] 下式中的星号表示所指残基与人胰岛素相比不同（即突变）。
[0025] SEQ ID No: 1 和2 或者，本发明的胰岛素可按照IUPAC命名法(OpenEye，IUPAC格式)命名。根据该命名 法，实施例1的胰岛素（即化合物1)被称为以下名称4{>-829}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S) -4-羧基-4- (19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-氨基]-乙氧基]-乙氧基]乙酰基]氨 基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[611^14,61仙16，出8825]，(^8-111沾30-胰岛素（人）。
[0026] 发明简述 本发明涉及胰岛素类似物的衍生物，即A14E，B16E，B25H，Β29Κ(Ν(ε)二十烷二酰基-gGlu-2x0EG)，desB30人胰岛素（化合物 1)。
[0027] 发明详述 已经出人意料地发现，A14E，B16E，B25H，Β29Κ(Ν(ε)二十烷二酰基-gGlu-2x0EG)， desB30人胰岛素满足上述目标至足够的程度。例如，用化合物1 一周一次或更低频率皮下治 疗将是糖尿病患者对基础胰岛素治疗的需要的令人满意的治疗。此外，化合物1在水性介质 (任选包含锌）中具有高的溶解度。在一个方面，化合物1具有比人胰岛素的溶解度高的溶解 度。
[0028] 在一个方面，化合物1在包含锌(例如至少5个锌离子/胰岛素六聚体、至少6个锌离 子/胰岛素六聚体、至少7个锌离子/胰岛素六聚体、至少8个锌离子/胰岛素六聚体或至少9 个锌离子/胰岛素六聚体)的水性介质中是可溶的，其中在制备后在等于或低于37°C贮存至 少4周后测量溶解度。
[0029] 在本发明的一个方面，化合物1在包含锌(例如至少5个锌离子/胰岛素六聚体、至 少6个锌离子/胰岛素六聚体、至少7个锌离子/胰岛素六聚体、至少8个锌离子/胰岛素六聚 体、至少9个锌离子/胰岛素六聚体、至少10个锌离子/胰岛素六聚体、至少11个锌离子/胰岛 素六聚体或至少12个锌离子/胰岛素六聚体）的水性介质中是可溶的，其中在制备后在24-48小时内测量溶解度。
[0030]在一个方面，按本文实施例7中所述测量溶解度。
[0031]包含化合物1的药物组合物可以本身已知的方式，即通过使用通常用于类似的胰 岛素组合物的赋形剂来制备。
[0032] 包含化合物1的可注射药物组合物可使用制药工业的常规技术制备，所述技术包 括在适当时，溶解和混合各成分以得到所需的最终产品。因此，根据一个程序，将化合物1溶 解在一定量的水中，所述量略微低于待制备的药物组合物的最终体积。按需加入等渗剂、防 腐剂和缓冲剂，和如果需要的话，按需使用酸例如盐酸或碱例如氢氧化钠水溶液调整溶液 的pH值。最后，用水调整溶液的体积得到所需浓度的成分。
[0033] 更准确地，本发明的胰岛素制剂，例如溶液，可通过在轻微酸性的条件下将化合物 1溶于水性介质中来制备。水性介质例如通过加入张力调节剂而使之等渗。此外，水性介质 可包含例如缓冲剂、防腐剂和锌离子。在不太靠近本发明的化合物的等电点的情况下将溶 液的pH值向中性调整，以避免可能的沉淀。最终胰岛素制剂的pH值取决于锌离子的浓度和 本发明的化合物的浓度。胰岛素制剂例如通过无菌过滤而使之无菌。
[0034] 药物组合物可包含一种或多种赋形剂。
[0035] 术语〃赋形剂〃在广义上是指除了活性治疗成分之外的任何组分。赋形剂可以是惰 性物质、无活性物质和/或无药用活性物质。
[0036] 赋形剂可用于各种目的，这取决于药物组合物，例如作为载体、溶媒、稀释剂、片剂 助剂，和/或用于改善活性物质的给予和/或吸收。赋形剂的实例包括但不限于稀释剂、缓冲 剂、防腐剂、张力调节剂（亦称为张度剂或等渗剂）、螯合剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂、湿 润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质和/或两性离子和稳定剂。 [0037]药学活性成分与各种赋形剂的药物组合物是本领域已知的，参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (例如第19版(1995)和任何后来的版本）。
[0038]以本身已知的方式，例如根据患者的一般知识结合医生的一般知识，将胰岛素组 合物给予患者。本发明最好按患者的便利来使用。因此，对每个患者研究具体的给药间隔， 其中比每日更低频率给予剂量。因此，最终的使用方式同时取决于产品的能力和患者的意 向及偏好。这是由于以下事实导致:任何胰岛素产品的效