一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体设及一种基于黄牛AngptlS基因单核巧酸 多态性的分子育种方法。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性（Single Nucleotide Polymo;rphism，SNP)是指基因组DNA序列中 由于单个核巧酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、 缺失W及重复序列拷贝数的变化。在二倍体生物群体中，SNP理论上可由2个、3个或4个等位 基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNP很罕见，故SNP通常被称为二等位基因分子标 记。根据SNP在基因组中分布的位置，SNP又可划分为基因编码区SNP( cSNP)、基因周边SNP (pSNP)和基因间SNPs (i SNP)等类型。其中cSNP造成的影响较大，可能影响到蛋白质的功能。 近年来的研究发现，5'侧翼区的SNPs，即pSNP对基因的功能也具有非常重要的调控作用，能 够影响整个基因的转录效率。
[0003] 分子育种，即分子标记辅助选择育种(Mole州lar Mark-Assist Selection,MAS)， 是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，借助DNA分子标记对遗传资源或育 种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，实现新品种的选育。标记辅助选择主要 经历了 Ξ个阶段:第一阶段是家畜各性状间的遗传分析;第二阶段是蛋白质（酶)标记对数 量性状的标记阶段;第Ξ个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术的日渐成熟与丰 富，覆盖整个基因组的标记越来越多，通过与QTL(quant;Uative化ait locus)间的连锁分 析，可间接实现辅助选择性状的目的。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、 遗传育种及多样性的研究。在肉牛育种中，人们期望通过对与生长性状有密切相关、并且与 数量性状紧密连锁的DNA标记进行选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在 畜禽育种中获得较大的研究进展。
[0004] 目前，主要采用几种不同的路线来筛别SNP:包括DNA序列测定方法、PCR-SSCP与 DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核巧酸连接反应、PCR-R化P或f orced-PCR- RFLP方法等。在运些SNPs检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是其检 测费用昂贵，需要有DNA测序仪等大型仪器，同时需要非常熟练的技术人员和丰富的经验， 因此该方法不是一种应用于生产实际的理想SNPs检测方法;利用PCR-SSCP与DNA测序结合 法检巧USNP可W适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实 验过程中存在假阳性问题，所W，也并非理想的SNP检测手段;AS-PCR方法作为一种新型的 SNPs检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引 物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普 遍应用的特点；而引物延伸法和寡核巧酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基 因忍片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综 上所述，利用PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP技术进行SNP检测可能是当前检测SNP最理想的 遗传标记方法。本试验中的f or ced-PCR-RFLP是在发现SNP位点后通过对引物中引入错配碱 基，使之与SNP位点共同构成酶切位点实现基因分型的一种方法。通过PCR扩增，使用限制性 内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙締酷胺凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNPs位点。 该方法既具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，是目前可 实际应用于生产实践的方法。
[0005] 血管生成素样蛋白（Angiopoietin-l;Lke proteins，An即tls)是一类既与血管生 成有关，又与脂类、葡萄糖、能量代谢和膜岛素敏感性密切相关的分泌性蛋白质因子，先后 发现了该家族的8个成员，命名为Angptll-8。其中AngptlS是最近发现的能在肝脏和脂肪组 织中表达并具有多种功能的活性多肤，又称为促膜岛生长素(betatro地in)。在人类及小鼠 中，AngptlS是一种由198个氨基酸组成的22kD的分泌蛋白。在培养的肝细胞中，An即tl8可 促进Angptl3的剪切，释放出Angptl3的N端，该N端结构域可抑制脂蛋白脂肪酶的活性。另有 研究表明，在小鼠中单独表达Angptl3不会改变血浆中Ξ酷甘油的水平，而与AngptlS共表 达后将引起高甘油Ξ醋血症;免疫共沉淀的结果显示An即tl8与An即tl3的N端结构域存在 一定的相互作用，AngptlS可能是通过激活An即tl3调节血浆中的甘油Ξ醋水平。采用 AngptlS基因缺失的小鼠做模型时也发现An即tl8基因缺失可严重扰乱甘油Ξ醋的新陈代 谢，重组AngptlS蛋白还会抑制LPL的活性。W上研究表明An即tl8是脂类、葡萄糖和能量代 谢的调制器，在糖脂代谢方面发挥着重要的调控作用。
[0006] SNP多态性的检测方法，最常见的有单链构象多态技术和直接测序等，但是，单链 构象多态技术操作繁琐，影响因素较多，容易出现假阴性问题，而直接测序法成本较高。加 之，中国地方黄牛An即tl8基因遗传变异的研究仍是空白。因此，有必要探索一种可W快速 检测基因组DNA序列中的单核巧酸多态性，W及基于该多态性的分子育种方法，用W改良我 国地方黄牛品种。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种基于黄牛AngptlS基因单核巧酸多态性的分子育种方 法，寻找与黄牛生长性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建 立。
[0008] 本发明一种基于黄牛An即tl8基因单核巧酸多态性的分子育种方法，W包含 AngptlS基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，W引物对P为引物，PCR扩增黄牛An即tl8基 因，获得PCR扩增产物；
[0009] 用限制性内切酶化nfl消化PCR扩增产物，获得酶切产物片段；
[0010] 对酶切产物片段进行聚丙締酷胺凝胶电泳；
[0011] 根据聚丙締酷胺凝胶电泳结果鉴定出黄牛AngptlS基因中第-308位具有单核巧酸 多态性，所述单核巧酸多态性为:TT基因型表现为148bp-条条带;CC基因型表现为13化P和 16bp两条条带;TC基因型表现为148bp、13化P和16bpS条条带；
[0012]分别分析TT基因型与黄牛生长性状、CC基因型与黄牛生长性状、TC基因型与黄牛 生长性状的关联性，得出TT基因型有利于黄牛生长性状的提高；
[0013] 将TT基因型作为提高黄牛生长性状的分子遗传标记，用于黄牛的分子育种；
[0014] 所述引物对P包括上游引物P1和下游引物P2，其中 [001引上游引物口1的碱基序列为:5/-6666〔46口'01；66了6441'-3/;
[0016]下游引物口2的碱基序列为:5/-666〔4口'66了6464664了46603/。
[0017]优选的，所述PCR扩增的反应程序为：
[001 引 95 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30s，65 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，30 ~35 个循环；72 °C 延伸lOmin。
[0019] 优选的，所述聚丙締酷胺凝胶电泳所用的聚丙締酷胺凝胶中，聚丙締酷胺的质量 浓度是12%。
[0020] 优选的，将TT基因型作为提高邦县红牛或南阳黄牛的生长性状的分子遗传标记。
[0021] 优选的，将TT基因型作为提高邦县红牛的胸围、腹围、腰角宽W及十字部高性状的 分子遗传标记。
[0022] 优选的，将TT基因型作为南阳黄牛的体斜长性状的分子遗传标记。
[0023] 本发明基于黄牛An即tl8基因单核巧酸多态性的分子育种方法，表明An甜tl8基因 第-308位的单核巧酸多态性能够作为提高邦县红牛胸围、腹围、腰角宽、十字部高和南阳黄 牛体斜长的分子遗传标记，