分析，结果表明 包含148bp，13化P和16bp条带的杂合子TC基因型个体其-308位的测序结果的确表示为T或C (由于是反向测序，运里的峰图表现为互补序列A或G)，如图4所示，自左向右第7个峰为两个 峰。而TT、CC基因型分别为T和C，测序峰图表现为互补序列A和G，为单一峰，如图4所示。需要 说明的是，"T "为突变位点，"方框"为该位点引物中引入的错配碱基。
[0114] 六、黄牛An甜118基因 SNP位点的频率统计分析
[0115] 1)基因型频率和等位基因频率
[0116] 基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Ρττ =Νττ/Ν，其中Ρττ代表某一位点的ΤΤ基因型频率;Νττ表示群体中具有ΤΤ基因型的个体数;Ν为 检测群体的总数量。
[0117] 等位基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的 公式可 W 写成:ΡΤ= (2NTT+NTal+NTa2+NTa3+NTa4+......+NTan)/2N式中，ΡΤ表示等位基因 Τ频率， 化Τ表示群体中具有ΤΤ基因型的个体数量，NTai表示群体中具有化i基因型个体数量，al~an 为等位基因 T的η个互不相同的复等位基因。
[0118] 本研究所设及的等位基因为Τ和C，所W具体的基因频率计算公式为：
[0119] Pt=(2Ntt+Ntc)/2N
[0120] Pc=(2Ncc+Ntc)/2N
[0121] 式中，Ρτ，Pc分别表示等位基因巧PC等位基因的频率，Νττ、化c和Ncc分别表示ΤΤ、TC和 CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。
[0122] 如表3所示的基因频率分布表，在不同黄牛品种中，AngptlS基因 SNP位点的T等位 基因频率变化幅度在44.2%~76.2%，C等位基因频率变化幅度在23.8 %~55.8%之间。符 合等位基因频率大于1.0%的SNP的定义，故本位点为单核巧酸多态位点。
[0123] 表3黄牛An甜tl8基因第-308位的基因型和等位基因频率分布表
[0124]
[0125] 屯、黄牛An甜tl8基因 SNP位点基因效应的关联性分析
[01%]分别分析TT基因型与黄牛生长性状、CC基因型与黄牛生长性状、TC基因型与黄牛 生长性状的关联性，找出有利于黄牛生长性状的基因型。
[0127] 基因型数据:Hinfl识别的基因型(TC和CC)
[0128] 生产数据:邦县红牛成年体尺性状，包括体高、体斜长、胸围、腹围、腰角宽、坐骨端 宽、十字部高、体重、重高比；南阳黄牛不同月龄生长性状，包括初生重，6月龄、12月龄、18月 龄和24月龄的体重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽和平均日增重。
[01巧]关联性分析模型：
[0130]先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正； 根据数据特征，应用SPSS(18.0)软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进 行分析时采用了固定模型：
[0131 ] Yi jki = Ji+BF i +M〇nthj+Gk+ei jki
[01创其中：Yi化功性状观察值，μ为总体均值，BFi为第i个品种和农场的固定效，Monthj为 第j个月观测的固定效应，Gk为第k个单SNP标记基因型的固定效应，ei耻为随机误差。
[0133] 邦县红牛的结果表明（见表4):在邦县红牛群体中，TT基因型个体的胸围、腰角宽、 十字部高均显著高于TC基因型个体(P<0.05)，ΤΤ基因型个体的腹围极显著高于TC基因型 个体(Ρ<0.01)，表明ΤΤ基因型有利于邦县红牛胸围、腹围、腰角宽W及十字部高性状的提 高，ΤΤ基因型可W作为提高邦县红牛的胸围、腹围、腰角宽W及十字部高性状的分子遗传标 记，用于邦县红牛的分子育种。
[0134] 南阳黄牛的结果表明（见表5):在南阳黄牛群体中，18月龄和24月龄ΤΤ基因型个体 的体斜长显著高于TC基因型个体(Ρ<0.05)，表明ΤΤ基因型有利于提高南阳黄牛的体斜长 形状，ΤΤ基因型可W作为提高南阳黄牛体斜长性状的分子遗传标记，用于南阳黄牛的分子 育种。
[0135] 表4 An甜tl8基因第-308位多态性位点与邦县红牛生产指标间的方差分析
[0136]
[0138] 注:数字肩部具有不同字母a或b，表示差异显著(P<0.05);具有不同字母A或B，表 示差异极显著(P<〇.01);具有相同的字母，表示差异不显著(P>〇.05)。
[0139] 表5 An甜tl8基因第-308位多态位点与南阳黄牛初生重及各月龄生产指标间的方 差分析
[0140]
[0141]
[0142] 注:数字肩部具有不同字母a或b，表示差异显著(P<0.05);具有不同字母A或B，表 示差异极显著(P<〇.01);具有相同的字母，表示差异不显著(P>〇.05)。
【主权项】
1. 一种基于黄牛AngptlS基因单核苷酸多态性的分子育种方法，其特征在于， 以包含Angptl8基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛 Angptl8基因，获得PCR扩增产物； 用限制性内切酶Hinfl消化PCR扩增产物，获得酶切产物片段； 对酶切产物片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定出黄牛AngptlS基因中第-308位具有单核苷酸多态 性，所述单核苷酸多态性为:TT基因型表现为148bp-条条带;CC基因型表现为132bp和16bp 两条条带;TC基因型表现为148bp、132bp和16bp三条条带； 分别分析TT基因型与黄牛生长性状、CC基因型与黄牛生长性状、TC基因型与黄牛生长 性状的关联性，得出TT基因型有利于黄牛生长性状的提高； 将TT基因型作为提高黄牛生长性状的分子遗传标记，用于黄牛的分子育种； 所述引物对P包括上游引物P1和下游引物P2，其中， 上游引物P1的碱基序列为:5~GGGGCAGCTCCGGGTGAAT-3S 下游引物P2的碱基序列为W -GGGCACTGGTGAGAGGATAGGC-3'。2. 根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为： 95°C预变性5min;94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸3〇8,30~35个循环；72°(：延伸 10min〇3. 根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的 聚丙烯酰胺凝胶中，聚丙烯酰胺的质量浓度是12%。4. 根据权利要求1所述的分子育种方法，其特征在于，将TT基因型作为提高郏县红牛或 南阳黄牛的生长性状的分子遗传标记。5. 根据权利要求4所述的分子育种方法，其特征在于，将TT基因型作为提高郏县红牛的 胸围、腹围、腰角宽以及十字部高性状的分子遗传标记。6. 根据权利要求4所述的分子育种方法，其特征在于，将TT基因型作为南阳黄牛的体斜 长性状的分子遗传标记。
【专利摘要】本发明公开了一种基于黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性的分子育种方法，以包含Angptl8基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Angptl8基因，获得PCR扩增产物，用限制性内切酶Hinf？I消化PCR扩增产物，获得酶切产物片段，对酶切产物片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定出黄牛Angptl8基因第-308位具有单核苷酸多态性，同时，将黄牛Angptl8基因单核苷酸多态性检测结果与黄牛的生长性状进行关联性分析，并将合适的基因型用于提高黄牛生长性状的分子育种，有助于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105671189
【申请号】CN201610217640
【发明人】马云, 付玮玮, 李芬, 郝瑞杰, 李俊雅, 陈宁博, 黄洁萍, 韩爽, 刘云云
【申请人】信阳师范学院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月3日