一种橡胶树抗寒基因和蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体设及一种橡胶树抗寒基因化ICEl和蛋白，及 其在提高橡胶树抗寒能力方面的应用。
【背景技术】
[0002] 己西橡胶树巧evea brasiliensis(Willd.ex A. Juss. )Muell.)是天然橡胶的主 要来源，不仅是海南省最重要的特色经济作物，也是我国重要的战略性资源。己西橡胶树原 产于亚马逊森林，为多年生落叶乔木，是典型的热带雨林树种，在高溫、高湿、静风和±壤肥 沃的环境下生长良好，但对低溫非常敏感，不耐寒(Priyadarshan PM.Contributions of weather variables for specific adaptation of rubber tree(Hevea brasiliensis Muell .-Arg)clones[J] .Genet Mol Biol ,2003,26(4) :435-440.)。目前，世界上主要产胶 国家均位于适宜橡胶树种植的气候带内，如马来西亚、泰国、印度尼西亚等;而中国植胶区 属于热带季风气候，主要分布在海南、广东、广西、福建、云南，并经常遭受低溫和台风等自 然灾害的侵袭。寒害是我国植胶区的主要自然灾害之一，不仅影响橡胶产量，而且直接威胁 着橡胶树的生存（Priyadarshan PM,Hoa TTT,Huasun H,deCk川口ivcsPS.Yielding potential of rubber(Hevea brasiliensis)in sub-optimal environments[J].Journal of Crop Improvement ,2005,14( 1-2): 221-247.)。如2008年初的寒潮使树木大面积枯死， 给我国橡胶产业带来了重大经济损失。虽然橡胶树已被成功引入我国，但寒害仍是限制植 胶业发展的瓶颈，因此解析橡胶树抵御寒害胁迫的分子机理是天然橡胶生产中急需解决的 重大问题之一。
[0003] 在模式植物拟南芥中，植物应对低溫胁迫的信号途径及关键基因都已鉴定得很充 分，其信号传导和分子作用模式如下：ICEUINDUC邸OF CBF EXPRESSION)是CBF基因的转 录激活因子，在低溫环境下，它可W特定结合到CBF启动子的MYC顺式作用元件上，激活CBF 的表达（Chinnusamy V,Ohta !,Kanrar S,Lee BH,Hon邑 X,Agarwal M,Zhu JK. ICEl :a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis [J].Genes Dev ,2003,17(8) :1043-1054.) XBF 转录激活因子是能够结合 CRT/DRE 核屯、元件 的一类转录因子，CRT/DRE元件（C-repeat/Dehy化ation responsive element)是Wccgac 为核屯、序列的一类顺式作用元件。CBF基因能够在低溫诱导下迅速表达，并结合到CRT/DRE 元件上，从而启动COR等下游功能基因的表达，促进植物抗寒（Baker SS,Wilhelm KS, Thomashow MF.The -region of Arabidopsis thaliana corlSa has cis-acting elements that confer cold-,drought-and ABA-regulated gene expression[J].Plant Mol Biol,1994,24(5):701-713；Stockinger EJ,GiImour SJ,Thomashow MF.Arabidopsis thaliana CBFlencodes an AP2domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE,a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].PNAS.1997, 94(3): 1035-1040.)。拟南芥中包含4个CBF转录因子，分别为CBFl、CBF2、CBF3和CBF4，在拟 南芥中过量表达CBFl或CBF3,转基因植株的抗寒能力要明显优于野生拟南芥(Gilmour SJ， Sebolt AM,Salazar MP,Everard JD,Thomashow MF. Overexpress ion of the Arabidopsis CBFStranscriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation[J].Plant F*hysiol,2000,124(4):1854-1865.)0目 前在拟南芥中发现了2个ICE基因，分别为ICE巧日1CE2, ICEl编码一个类似MYC的地LH型转录 激活因子，ICEl的过量表达植株耐寒能力明显强于野生型拟南芥。将ICE2基因转入拟南芥 后，转基因拟南芥可W在-20°C的低溫环境下存活并正常生长，并且转基因株系中CBFl的表 达能明显增强（I^irsova OV,化gore化0 GV,!"arasov VA. Identification of ICE2,a gene involved in cold acclimation which determines freezing tolerance in Arabidopsis thaliana[J] .Gene,2009,429(1) :98-103.)。反之，突变体icel对冷胁迫表现 为超敏感。转录组分析的结果表明：在icel突变体中40%的冷胁迫调控的基因 W及46%冷 胁迫调控的转录因子的表达量都被下调。并且，icel突变体中参与巧信号、受体蛋白激酶W 及脂质信号的冷诱导基因也受到了影响(Xee册,Henderson DA,Zhu JK.The Arabidopsis cold-responsive transcriptome and its regulation by ICEl[J].Plant Cell,2005, 17(11) :3155-3175.)。进一步，对突变体W及转基因拟南芥冷应答的转录组忍片数据进行 生物信息学分析的结果表明，ICEl在低溫胁迫的信号途径中是一个至关重要的转录激活因 子，在ICE-CBF转录级联反应的转录水平调控网络中发挥重要作用（Benedict et al.， 2006)。并且，R2R3型MYB转录因子MYB15能与ICEl相互结合，并结合到CBF启动子区Myb识别 位点，负调控CBF的表达（Catherine B,Matt G,Johan T,Norman H,Vau曲an H.Consensus by democracy.Using meta-analyses of microarray and genomic data to model the cold acclimation signaling pathway in Arabidopsis[J].Plant Physiol,2006,141 (4): 1219-1232.)。此外，SMU0(small ubiquitin-related modifier化3连接酶SIZl和泛素 降解E3连接酶HOSl可W从翻译后水平修饰ICEl进而调控ICE-CBF信号通路（Dong CH， Agarwal M, Zhang Y,Xie Q,Zhu JK. The negative regulator of plant cold responses,HOSl, is a RING ESligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICEl [J]. PNAS, 2006，103(21): 8281-8286.)。可见，ICEl是低溫胁迫信号 传递通路中重要的转录激活因子，是连接冷信号和下游应答基因的关键因子。
[0004] 然而，针对己西橡胶树低溫胁迫信号途径的研究还处在刚刚起步阶段。截至目前， 上述信号通路中包括化ICEl在内的大部分基因尚未被克隆或鉴定，运成为橡胶抗寒机理研 究中的瓶颈。
【发明内容】
[0005] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于克隆一种橡胶树抗寒基因化ICEl和蛋 白，该基因过量表达后可W能有效提高植物对低溫的耐受能力，从而应用于耐寒品种的培 育。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种橡胶树抗寒基因化ICEl和蛋白在橡胶树抗寒 品种培育中的应用。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，发明人利用其课题