达载体，并转化到拟南芥中，拟分析过量表达植株的抗寒能 力。
[0030] W测序正确的19T-化I CE 1为模板，W设计带有ECORl酶切位点的引物进行PCR扩 增，利用胶回收试剂盒将PCR扩增产物进行回收(购自上海生工公司，中国），利用ECORl酶切 回收产物获得化ICEl基因的目的片段，同时酶切PEGAD载体，并将目的基因片段与ECORl酶 切的阳GAD载体大片段Wo . 8:1的比例混合，加入T4DNA连接酶（购自Takara公司）IU，1 X反 应缓冲液，无菌水补充至10化体系，16°C链接10小时，取10化连接产物进行热击转化大肠杆 菌D册a感受态细胞，涂布于新配置的卡那化m)50mg/L抗性平皿上筛选阳性克隆并酶切检 测。经PCR检测鉴定阳性克隆并抽提质粒。最后酶切检测条带大小与原PCR产物的长度一致， 将转化菌做穿刺管送到上海生工进行测序。构建pEGAD-冊ICEl植物表达载体的流程见图2。
[0031] 3、遗传转化及转基因植株的鉴定
[0032] 将构建好的植物表达载体祀GAD-化ICEl采用热激法转到农杆菌GV3101感受态细 胞中，用含利福平(Rif)l〇〇mg/L，卡那化m)50mg/L的YEB固体抗性平皿筛选转化阳性斑，挑 取若干个阳性斑进行菌落PCR检测，经菌落PCR后电泳检测显示出HOObp左右的条带，与 化ICEl大小一致，见图3。确认为阳性的菌株保存用于后续的遗传转化。利用浸花法将含有 目的质粒PEGAD-HbICEl的农杆菌GV3101转化到野生型拟南芥中。具体方法如下：将含有目 的质粒的农杆菌GV3101菌株接种到100mL含有卡钢霉素和庆大霉素的双抗液体LB培养基 中，在28 °C的摇床中W25化pm的转速培养两天。W5000巧m的转速离屯、IOmin，收集菌体，然 后将菌体重悬到100mL 5 %薦糖和0.05%的表面活性剂的溶液中，将农杆菌充分重悬。待转 化的植株花开的比较茂盛的时候，将拟南芥的花在农杆菌转化溶液中短暂浸泡15到30秒左 右。将转化过的植株用盖子盖上，将转化植株避光保存1天，然后掀开盖子正常培养。为了提 高转化效率，可W在转化一周后再次对植株进行农杆菌侵染转化。待小苗生长到两周时，利 用除草剂筛选出具有basta抗性的阳性植株。然后利用基因组试剂盒巧泰克，中国）提取初 筛的阳性苗的DNA，利用冊I CE 1特异性引物进行PCR从DNA水平检测重组质粒阳GAD-化I CE 1 是否成功转入到拟南芥中。PCR后电泳检测结果显示扩增出的条带与目的基因的条带大小 一致，见图4。初步从DNA水平证明工程菌成功转入拟南芥植株中。进一步，我们利用RNA试剂 盒(天根，中国）提取转基因植株的RNA进行RT-PCR检测橡胶树的化ICE1是否在拟南芥中表 达，结果表明化ICEl能在拟南芥中大量表达，见图5。将鉴定出的阳性转基因植株进行传代， 并获得纯合体。
[0033] 4、转基因株系抗寒能力的鉴定
[0034] 为了验证化ICE1基因在抗寒方面的功能，发明人将转基因株系9#、11 #、17#和对照 WT (转基因所用的受体材料）同时种植在1 /2MS (S i gma，美国）培养基上，4 °C避光处理3天。然 后将其置于光照培养箱中培养14天，培养条件如下:溫度为22± TC,相对湿度控制在50%-60%之间，光照强度为100曲1〇1 m-2s-l，光周期为长日照16L/8D。然后将小苗在(TC冷适应2 天，-8°C处理地，接着将处理过的小苗置于正常条件下培养7天，观察表型并拍照统计各植 株的纯合率。实验结果表明：经冻害处理后，在拟南芥中过量表达化ICEl基因的转基因株系 的纯合率明显高于对照野生型（图6)，证明我们在橡胶树中所克隆的基因化ICEl确实具有 抗寒的功能，是一个能在橡胶树抗寒品种选育的应用上很具潜力的功能基因。
[0035] 5、化ICEl亚细胞学定位的研究
[0036] 由于ICEl是一个转录因子，并且ExPASy分析表明化ICEl运个蛋白可能定位在细胞 核，为了研究化ICEl运个蛋白的亚细胞定位，进一步阐释化ICEl的功能，我们构建了融合载 体pCAMBIA 1300-eGFP-HbICEl，构建中所用的引物序列详见表1，构建过程与上述融合载体 祀GAD-冊ICEl相似。
[0037] 表1构建pCAMBIA 1300-eGFP-冊ICEl载体PCR扩增基因特异引物 [00；3 引
[0039] 将成功构建的融合载体pCAMBIA 1300-eGFP-化ICEl利用电击法转化到农杆菌 LBA4404中。将含有目的质粒的农杆菌单菌落LBA4404接种到5mL含卡那霉素、庆大霉素和利 福平的YEP液体培养基中，30°C，200巧m过夜;取30化培养液转至30mL含相同抗性的YEP液体 培养基中，30°C，200rpm至ODsoo=I .5;5000;rpm 15min，弃上清；加30mL重悬液重悬，5000巧m Smin，弃上清；加重悬液使ODs日日=1.0，室溫静置2-化。用注射器吸取菌液，挑选生长状况良 好的健康烟草叶片，从叶背面避开叶脉处将菌液从气孔注射进烟草，标记叶片，培养3-5d至 叶片注射处呈淡黄色可做定位观察。将注射有目的基因的叶片组织制片，利用激光共聚焦 显微镜检测其定位情况。绿色巧光GFP的激发波长和发射波长分别是488nm和508nm。观察结 果表明：当对照载体(pCAMBIA1300-eGFP)转入烟草后，检测绿色巧光会充满整个细胞，而在 转化融合载体pCAMBIA1300-HbICEl的烟草叶片中，绿色巧光与细胞核特异染料DAPI的巧光 部位重合(图7)，表明化ICEl定位于细胞核，暗示化ICEl是一个转录因子。
[0040] 6、化ICEl的表达模式分析
[0041] 为了研究化ICEl在橡胶树各个组织中的表达情况，我们提取橡胶树胶乳、叶片、茎 尖、树皮、雌蕊和雄蕊等六个不同组织的RNA，并反转录成为cDNA，W不同组织中的CDNA为模 板进行巧光定量PCR检测，具体操作步骤参照Takara公司的Real Time PCR试剂盒及 AB口SOOReal Time PCR仪。巧光定量的PCR的引物详见表2。
[0042] 表甜bICEl基因特异引物
[0043]
[0044] WR册作为内参，巧光定量PCR的结果显示，化ICEl在橡胶树的各个组织中都有表 达，且在树皮中的表达量最为显著，见图8。为了进一步阐释化ICEl在橡胶树寒害胁迫中的 作用，申请人将橡胶树置于4°C低溫下处理不同时间，检测其表达水平的变化，结果表明 化ICEl受冷胁迫诱导，并且在化后达到最高，见图9。W上结果暗示橡胶树化ICEl基因在橡 胶树抗寒信号传递的过程中起到重要作用。
[0045] 综上所述，本发明在橡胶树中所克隆的基因化ICEl确实具有抗寒的功能，是一个 能在橡胶树抗寒品种选育的应用上很具潜力的功能基因。
【主权项】
1. 一种橡胶树抗寒因子HbICEl蛋白，它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所示。2. 编码橡胶树抗寒因子HbICEl蛋白的多核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于:该序列为序列表中SEQ ID NO: 1 所示，或者是SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突 变而获得的保守性变异体。4. 包含权利要求2或3所述多核苷酸序列的表达载体。5. 根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：它是pMD18-T载体、pCAMBIA1300载体 或PEGAD载体。6. 包含权利要求4或5所述表达载体的细胞。7. 根据权利要求6所述的细胞，其特征在于:它是大肠杆菌DH5a或农杆菌GV3101。8. 权利要求1所述的氨基酸序列SEQ ID NO:2在植物抗寒品种培育中的应用。9. 权利要求2或3所述的多核苷酸序列SEQ ID NO: 1在植物抗寒品种培育中的应用。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于:所述的植物为橡胶树、拟南芥。
【专利摘要】本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种橡胶树抗寒关键基因HbICE1和蛋白，及其在提高植物抗寒能力方面的应用。本发明克隆得到一种与橡胶树抗寒相关的基因HbICE1，该基因的CDS序列如序列SEQ ID NO.1所示，它的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO.2所示。遗传转化表明，该基因可提高拟南芥抗寒的性能，能在橡胶树抗寒品种选育和遗传改良中应用，为橡胶树提供了一种新的基因资源。
【IPC分类】C12N15/29, C07K14/415, A01H5/00, C12N1/21, C12N15/82
【公开号】CN105693836
【申请号】CN201610223867
【发明人】袁红梅, 欧阳沫, 黄惜, 唐潇, 王启超, 曹玉鑫, 陈伟杰
【申请人】海南大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月12日