鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品的制作方法
【专利说明】
[000。 本申请是申请号为"201410196203.2"，申请日为"2014年5月9印'，发明名称为"鸡 新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，尤其设及利用重组杆状病毒在昆 虫体内制备鸡新城疫病毒抗原的方法W及由该制备方法得到重组抗原，本发明还设及一种 鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法及其产品，本发明进一步设及它 们在预防、治疗或诊断鸡新城疫疫苗或试剂中的用途，属于鸡新城疫病毒抗原的制备和应 用领域。
【背景技术】
[0003] 新城疫于1926年首先发现于印度尼西亚，同年发现于英国的新城，由于新城疫危 害严重，国际兽疫局(OIE)把新城疫定为烈性传染病，给养殖业带来巨大经济损失。世界动 物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病。因此，寻找一种理想的免疫保护性抗原用于该 病的快速诊断与免疫防治十分迫切。
[0004] 随着杆状病毒作为载体，在体外和体内转导动物细胞并获得目的蛋白的高效表 达，杆状病毒日益显示了其作为非复制型载体在基因治疗中的应用前景，开辟了杆状病毒 应用研究的新领域化iiser A.Am J陆armacogenomies,3(1 ):53-63,2003)。从杆状病毒表 达系统建立W来，已有1000多种外源基因在运一系统中得到了表达。1985年，Maeda用家蚕 Bombyx mori NPV作表达载体，在家蚕体内高水平地表达出人a干扰素W来，W中国和日本 为代表的有蚕国家，不断发展家蚕杆状病毒表达系统，已成为比较成熟的一种蛋白表达技 术（吕鸿声.昆虫病毒分子生物学免疫研究，1998)。与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统相 比，家蚕杆状病毒表达系统在一定方面具有许多优势，因此充分利用家蚕资源来生产外源 蛋白，对生物医药产业具有重要意义。但是，至今尚无利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体 内成功表达鸡新城疫病毒抗原的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用家蚕杆状病毒 表达系统在昆虫体内表达鸡新城疫病毒抗原的方法。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过W下技术方案来实现的：
[0007] 本发明提供了一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，包括W下步骤：
[0008] (1)将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O克 隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体;或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸 酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O克隆到杆状病毒运载载体 中，构建得到转移表达载体;或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒 的糖蛋白基因F-O与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝 素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达 载体；
[0009] (2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞W发生同源重组 或转座，获得重组杆状病毒；
[0010] (3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞;培养被感染的昆虫宿主或昆虫细 胞，诱导表达相应的鸡新城疫病毒抗原;收获并纯化所表达的抗原。
[0011] 本发明还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法， 该方法包括W下步骤：
[0012] (1)将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与 哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体;或者将鸡 新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-0与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体;或者优 化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 HN-O串联在一起的序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到 转移表达载体；
[0013] (2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞W发生同源重组 或转座，获得重组杆状病毒，将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞扩增重组杆状病毒， 即得。
[0014] 所述鸡新城疫病毒基因F的核巧酸序列为SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示;优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O的核巧酸序列为SEQ ID NO.5所示， 其氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示;所述鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN的核巧酸 序列为SEQ ID NO. 3所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示;所述优化后的鸡新城疫病毒 血凝素神经氨酸酶基因HN-O的核巧酸序列为SEQ ID NO.7所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示;所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F-O与优化后的鸡新城疫病毒血凝 素神经氨酸酶基因HN-O串联在一起的序列(F-IRES-HN-O)为SEQ ID NO.9所示。
[0015] 所述的杆状病毒运载载体选自 AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWa-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、BlucBacII(祀化）、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEI、pAcJPI、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF 8、 pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG，pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、 pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、 地 acl、地 ac2、地 lueBacIII、地 IueBa 地 is、祀 ￥55、111乂1￥，口161化〇、口1￥6化、口1￥化61、口1￥口10、 pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pW(MEXl.l、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV ￥1-、9化1391、9化 1392、9化 1393、9￥1941、9化 945、9￥1 985、9￥18曰。、981030、91^(：-5或其 它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，优选为PVL1393杆状病毒运载载体。
[0016] 所述的哺乳动物细胞启动子包括但不限于CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人 巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人 Ieukosial in基因启动子、鼠3-憐酸甘油激酶1基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡0-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子、鼠乳房瘤病毒启动子;优选为CAG启 动子。
[0017] 所述的杆状病毒选自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、 OpMNPV、SIMNPV、SeMNPV或Sp 1 tNPV;优选为家蚕杆状病毒亲本株BmNPV。
[0018] 本发明中所构建的重组杆状病毒包括：（1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-NDV-F JBmNPV-NDV-F-O 或 rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-0;(2)重组家蚕核型多角体病毒 rBmNPV-CAG-NDV-F-O或rBmNPV-CAG-NDV-F-1RES-HN-O。所述的昆虫宿主选自家蚕（BombyX mori )、野蚕 (Bombyx mandarina)、藍麻蚕（Phi Iosamia cynthia ricim)、精蚕（Dictyoploca japanica)、轉蚕（Philosamia cynthia pryeri )、昨蚕（Antheraea pernyi)、日本昨蚕 (Antheraea yamamai )、野天蚕（Antheraea po Iyphymus )、首猜尺暧（Atographa califorica)、茶尺暧化Ctropis obliqua)、甘兰夜蛾（Mamesha brassicae)、斜纹夜蛾 (Spodoptera Iittoralis)、秋粘虫（Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)、行军虫（Thaumetopoea wiIkinsoni)、棉铃虫（胎Iiothis armigera)、美国棉铃虫 巧eliothis zea)、烟青虫巧eliothis assul1:a)、烟草夜蛾巧eliothis virescens)、东方 粘虫（Pseudaletia separata)、舞毒蛾化 ymantria dispar)等；优选为家蚕（Bombyx mori) O
[0019] 本发明中所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫 幼虫或蛹体;更优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或 蛹，在感染3-6天后收集含各种鸡新城疫病毒糖蛋白抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀 浆;其中，所述的蛹体最优为1-2天的早期嫩蛹。
[0020] 鸡新城疫病毒抗原基因F、优化的基因F-0、鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN-O W及串联的F-IRES-HN-O基因在多 角体启动子、CAG启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，在家蚕中高效表达鸡 新城疫病毒抗原，所表达的抗原或所构建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性，能够为包 括鸡在内的动物提供良好的免疫保护，可用于制备预防鸡新城疫的疫苗或药物组合物。
[0021] 本发明所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体通过注射或口服 等方式将其进入到动物体内后，能在动物体内高效呈递抗原基因，有效抵御新城疫病毒的 攻击。
[0022] ELISA检测表明，本发明中所构建的重组杆状病毒rBmNPV-NDV-F中NDV-F基因在家 蚕中表达量高，平均每头家蚕或蚕蛹中的表达量至少Img，在3200倍稀释甚至更高稀释度下 仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后家 蚕血淋己样品的上清液中可检测到59kD大小的特异性条带。动物免疫实验证明，NDV-F基因 实验组全部产生针对NDV的抗体，50支苗/组实验组的检测效价可达1600倍W上；而对照组 没有检测到抗体;攻毒后，50支苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡， 表现典型的鸡新城疫症状。
[0023] 本发明所构建的重组杆状病毒巧mNPV-NDV-F-0中NDV-F-O基因在家蚕中表达量 高，比NDV-F基因在家蚕中表达量高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到 抗原与抗体的特异性反应。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后家蚕血淋己样 品的上清液中可检测到59kD大小的特异性条带。动物免疫实验证明，实验组全部产生针对 NDV的抗体，100支苗/组实验组检测效价可达3200倍W上；而对照组没有检测到抗体;攻毒 后，100支苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫 症状。
[0024] ELISA 法检测 rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-0 中 NDV-F-IRES-HN-O 抗原蛋白表达量，结果 表明，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。Western blotting结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋己样品的上清液中可检测到F、HN蛋白大 小约为59kD、64kD的特异性条带。动物免疫实验证明，实验组全部产生针对NDV的抗体，200 支疫苗/组实验组检测效价可达3200倍W上；而对照组没有检测到抗体；攻毒后，200支疫 苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
[0025] 用本发明所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体rBmNPV-CAG-NDV-F-O(或重组杆状病毒rBmNPV-CAG-NDV-F-0)注射或口服实验鸡，实验组全部产生针对 NDV的抗体，抗体滴度达到1600左右，而对照组检测到的抗体滴度在20左右;攻毒后，免疫组 没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。用所构建的鸡新 城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载!"BmNPV-CAG-NDV-F-I RES-HN-O (或重组杆状病毒 rBmNPV-