目的片段与载体连接
[0306] 连接体系；
[0307]
[0308] 16°C反应8-12h，转化大肠杆菌感受态细胞得到重组质粒。抽提重组质粒并进行酶 切鉴定;将酶切鉴定为阳性克隆命名为PVL1393-CAG-NDV-F-IRES-HN-0的菌种进行测序，巧U 序结果证明构建正确。
[0309] 3鸡新城疫F-IRES-HN-O基因重组到BmNPV DNA上得到F-IRES-HN-O基因的呈递载 体
[0310]接种约0.5~IX IO6Bm-N细胞于15cm2培养瓶中，贴壁培养过夜（即细胞密度约为 80 % )。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞二次，再加ImL无血清培养基。在50化反 应体系中加入上述BmNPV的DNA化g，pVL1393-CAG-NDV-F-IRES-HN-O质粒DNA化g，脂质体化 L混合，加水补足体积，轻轻混匀，27 °C溫育15min，逐滴加入培养瓶中，边加边摇匀。27 °C培 养4~化后倾去含转染液的无血清培养基，补加4.5mL无血清培养基并加入5(K)化的FBS，使 其终浓度为10%，封口，27°C培养4~5d，至细胞浮起后，收集上清液用于重组呈递载体的筛 选和表达。
[0311 ] 4重组载体BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O的筛选、纯化和扩增
[0312] 接种适量Bm细胞(平皿底部面积的80%)于35mm小dish中，27°C培养1加至细胞贴 壁后，吸去培养基，将共转染上清液按1(T 3~ICT5作适当稀释后，取ImL稀释液加到贴壁细胞 中，分布均匀。27°C感染比，将2%低融点琼脂糖凝胶于60°C水浴中融化，冷至40°C与等体积 经40°C预热的2XTC-100培养基(含20%FBS)混合均匀，添加X-gal使其终浓度达150iig/mL， 沿小di Sh边缘将胶慢慢倒入，凝固后用化rafi Im封口，27 °C倒置培养4~7d。显微镜下选取 无多角体重组病毒空斑，超净台内用Tip头挑取重组病毒斑，溶于40化L TC-IOO培养基中，4 °C放置4h使病毒粒子释放出来。
[0313] 取I(K)化病毒液感染24孔板中的细胞，27°C培养3d后，取15化L感染细胞上清按碱 变性法快速制备病毒基因组DNA，进行PCR扩增分析，发现33个斑的病毒都为含F-CKHN-O基 因的重组病毒BmNPV,将能扩增出目的片段的病毒上清液铺斑进行第一次筛选，最终获得含 目的基因的纯重组病毒。
[0314] 分别取10化L纯重组病毒感染正常生长的Bm-5贴壁细胞，在感染后约5d待细胞浮 起后，4°C保存，用W感染。
[031引 5基因呈递骨架载体BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O在家蚕中的扩增
[0316] 将上述重组病毒BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O培养液按l〇5pfu/头注射五龄幼蚕，待家 蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20°C冻存，得到含有F-CKHN-O基因的家蚕杆状病毒呈递载 体。
[0317] 6巧光定量PCR
[0318] 6.1样品的处理
[0319] 取50化前述的血淋己样品，加入等体积的1 .OM化OH轻轻混匀，室溫作用5min，然 后每管加10化的IOM NHaAc,室溫作用5min，轻轻摇匀W中和碱液，作用完毕后，用饱和酪， 氯仿:异戊醇(24:1)去除蛋白，用2.5倍体积的乙醇沉淀总核酸，沉淀经75%酒精洗后真空 抽去残余的酒精，沉淀溶于20化TE。取化L上述DNA作为PCR的模板。
[0320] 6.2引物设计
[0321] F-IRES-HN-O 上下游引物：
[0322] NDVF-F4：5'-TGTGGCTCGGAAATAACACTC-3'；
[0323] NDVH-Rl:5 '-CAGCACGACCCTATTGACTG-3 '；
[0324] 巧光定量PCR程序如下：951：3111111;951：4036(3,601：4036(3,721：4036(3,40个循环。
[0325] 标准曲线的制作:根据BmNPV-CAG-F-IRES-HN-O中F-IRES-HN-O基因设计引物进行 巧光定量PCR，F-IRES-HN-0通过PCR扩增后克隆到pGEM-T载体上，测定重组T载体浓度并进 行10倍梯度稀释，对每个稀释样品用F-IRES-HN-O特异引物进行3次qPCR，生成标准曲线。对 每组提取DNA用F-IRES-HN-O特异引物进行3次qPCR。
[0326] 结果显示，每毫升蚕体血淋己中分别含有约l〇w个F-IRES-HN-O基因的DNA拷贝。
[0327] 7动物免疫实验
[0328] 按国家标准（中华人民共和国兽药典)将含BmNPV-CAG-NDV-F-IRES-HN-O的重组病 毒（即外源基因NDV-F-IRES-HN-O基因可由哺乳动物启动子驱动表达的重组BmNPV病毒)初 步纯化，用含初步纯化的IO 8P化重组病毒注射或口服育成鸡，在免疫后21天后取血，进行 ELISA抗体效价检测。结果表明，实验组全部产生针对NDV的抗体，抗体滴度达到3200左右， 而对照组检测到的抗体滴度在20W下;在免疫后30-35d进行攻毒实验，免疫组的没有鸡死 亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。
【主权项】
1. 预测后优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因 HN-O,其特征在于：其核苷酸序列为 SEQIDN0.7**。2. 含有权利要求2所述优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因 ΗΝ-0的表达载体;优选 的，所述的表达载体是杆状病毒表达载体。3. -种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将权利要求1所述的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 ΗΝ-0克隆到杆状病毒运 载载体中，构建得到转移表达载体;或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因 F或优化后的鸡新城 疫病毒的糖蛋白基因 F-0与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 HN或权利要求1所述的优 化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 ΗΝ-0串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载 载体中，构建得到转移表达载体； (2) 将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒； (3) 将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞;培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞，诱 导表达相应的鸡新城疫病毒抗原;收获并纯化所表达的抗原。4. 一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 将权利要求1所述的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 ΗΝ-0与哺乳动物细胞启 动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体;或者将优化后的鸡新城疫 病毒的糖蛋白基因 F-0与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 ΗΝ-0串联在一起的 序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体； (2) 将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒； (3) 将重组杆状病毒感染昆虫宿主，扩增重组杆状病毒，即得。5. 按照权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于:所述优化后的鸡新城疫病毒血凝 素神经氨酸酶基因 ΗΝ-0为SEQ ID NO.7所示;所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因 F-0 与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因 ΗΝ-0串联在一起的序列为SEQ ID NO.9所 不。6. 按照权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述的杆状病毒运载载体选自 AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl_lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、 p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、 pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF 8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP 25、pAcRW4、pAc sMAG，pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、 pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、 pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV，pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、 pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSH0NEX l.l、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、 pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030或pUAC-5;优选为 PVL1393； 所述的杆状病毒选自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、 S1MNPV、SeMNPV 或 Sp 1 tNPV;优选为 BmNPV; 所述的昆虫宿主包括：家蚕（Bombyx mori)、野蚕（Bombyx mandarina)、蓖麻蚕 (Philosamia cynthia ricim)、棒香（Dictyoploca japanica)、得香（Philosamia cynthia pryeri)、柞香（Antheraea pernyi)、日本柞香（Antheraea yamamai)、野天香（Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖（Atographa califorica)、茶尺蠖（Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾 (Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis)、秋粘虫（Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)、行军虫（Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫 (Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草 夜蛾（Heliothis virescens)、东方粘虫（Pseudaletia separata)或舞毒蛾（Lymantria dispar)及相应的昆虫细胞;优选为家蚕； 所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体； 优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天 后收集含各种抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆或在昆虫体内繁殖的重组病毒;最优 蛹体为1-2天的早期嫩蛹。7. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于:所述的哺乳动物细胞启动子包括但不 限于CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动 子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosial in基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶1基因启动 子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子、鼠 乳房瘤病毒启动子;优选为CAG启动子。8. 由权利要求3-7任何一项制备方法制备得到的重组鸡新城疫病毒抗原或鸡新城疫病 毒抗原基因家蚕杆状病毒基因呈递载体。9. 权利要求8的重组鸡新城疫病毒抗原或鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒基因呈 递载体在制备预防、治疗或诊断鸡新城疫疫苗或试剂中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品。本发明根据病毒流行趋势预测将鸡新城疫病毒F基因以及HN基因进行优化。本发明进一步将鸡新城疫病毒糖蛋白抗原基因、优化后的抗原基因或串联的优化抗原基因组合在家蚕生物反应器中进行表达，所表达的抗原或制备的重组病毒能为动物提供有效的免疫保护。本发明还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因呈递载体的制备方法，包括：将鸡新城疫病毒抗原优化基因或串联的优化抗原基因组合克隆进哺乳动物启动子控制的杆状病毒运载载体中，重组得到含哺乳动物启动子控制的基因呈递载体；通过注射或口服等方式将其进入到动物体内后，能在动物体内高效呈递抗原基因，有效抵御新城疫病毒的攻击。
【IPC分类】C12N15/56, C12N15/45, A61K39/17, C12N15/866, A61P31/14
【公开号】CN105695491
【申请号】CN201610121287
【发明人】张志芳, 李轶女, 王智权, 易咏竹, 李浩洋, 李田田, 胡小元
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年5月9日