biochemical characterization of the purified recombinant LIPllipase. J Agric Food Qiem，2006,54:815-822.)。但事 实上仍然存在很多相反的情况，基因经密码子优化后其表达水平可能会下降，只是运种研 究案例通常难W公开发表。也有研究人员对密码子与表达水平的关系持有不同意见化enry I曰n,et 曰1.,Predicting gene expression level from codon usage bi曰s[J].Mol Biol Evol ,2007,24(1) :10-12.),甚至有研究表明并非所有的稀有密码子都会降低表达水平 (Chinnathambi T.et al.,Rare codon priority and its position specificity at the 5'of the gene modulates heterologous protein expression in Escherichia coli[J].Biochem Bio地ys Res Commun,2008,376(4):647-652.)。因此，简单的密码子优 化并不能总是提高表达水平，还须辅W其他的技术手段，如GC含量在不同基因区域的分布 比例，密码子适应指数kodon adaptation index，CAI)等，并进行大批量的验证，才能得到 高效表达的突变基因。
[0010] 果胶裂解酶基因在酵母中的分泌表达量不高，纯化回收率很低，导致其不能被广 泛应用，亟待改进。
【发明内容】
[0011] 本发明目的之一是对果胶裂解酶基因的序列进行优化，得到一种在酵母中分泌表 达量有显著提高的果胶裂解酶优化基因；
[0012] 本发明目的之二是提供含有上述果胶裂解酶优化基因的重组表达载体W及该重 组表达载体的重组宿主细胞；
[0013] 本发明目的之=是将所述果胶裂解酶的优化基因W及含有该优化基因的重组表 达载体和重组宿主细胞应用于果胶裂解酶的生产。
[0014] 本发明为达到W上目的，采取的技术方案为：
[0015] 本发明将黑曲霉(Aspergillus niger)来源的果胶裂解酶基因pnlzj5b(SEQ ID NO. 1)在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑多种因素，包括不限于密码子使用频 率，不同基因区域GC含量的分布，密码子适应指数CAI，不稳定序列的删除等，对果胶裂解酶 基因序列进行多种策略的优化，得到3个果胶裂解酶突变基因pn 1Z j加-m2，pn 1Z j加-m3和 口11山巧13-1114，其核巧酸序列分别为沈9 10^.2、569 10^.3和沈9 10^.4所示。
[0016] 本发明进一步提供了含有果胶裂解酶突变基因的重组表达载体W及含有该重组 表达载体的宿主细胞;其中，优选的，所述重组表达载体是重组真核表达载体，更优选为重 组毕赤酵母表达载体；优选的，所述的宿主细胞优选为酵母细胞，更优选为毕赤酵母 (Pichia pastoris)细胞。
[0017]本发明将3个果胶裂解酶突变基因化个野生型基因转入到毕赤酵母中进行表达， 试验结果表明：筛选出转果胶裂解酶原始基因（pnlzjSb)和优化基因（pnlzj5b-m2， pnlzj加-m3，pnlzj5b-m4)的酵母转化子100株中，各转化子的阳性率均在43%-46%之间。 其中，挑选出转pnlzjSb的酶活最高的菌株，其在摇瓶分泌表达的果胶裂解酶酶活性为 4.2U/mL，而转pnlzj5b-m2的菌株最高酶活为6.7U/mL，转pnlzj5b-m3的菌株最高酶活为 2.1U/mL，转pnlzj5b-m4的菌株最高酶活为4.4U/mL。转pnlzj加-m2的菌株的酶活明显高于 牵专 pnlzj 5b、pnlzj 5b_m3、pnlzj 5b_m4 的菌株。
[001引将上述4株表达水平最佳的毕赤酵母重组菌株在3升发酵罐水平诱导产酶发酵，结 果表明：转原基因的酵母转化子pnlzjSb在甲醇诱导12化后果胶裂解酶的活性为150U/mL， 而转911^^'513-1112的酶活诱导12化后则达到了5321]/1111^，是野生型的3.5倍。但突变基因 pnlz巧b-m3发酵水平仅为4抓/ml,较野生型降低了 70%;pnlz巧b-m4的发酵水平为171U/ ml,较野生型提高了 14%，与野生型无显著差异。
[0019] 本发明将黑曲霉来源的果胶裂解酶经多种策略的基因序列优化后得到的多个优 化基因中，口11山巧6-1112(56〇10^.2)能够显著提高该酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量， 而其它优化基因经优化后仍不能提高表达水平(pnlz巧b-m3)，甚至下降(pnlz巧b-m4)。
[0020] 本发明还提供了一种制备果胶裂解酶的方法，包括:将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的果胶裂解酶优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载 体;将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株;培养重组菌株，诱导重组果胶裂解 酶的表达，回收并纯化所表达的果胶裂解酶，即得；
[0021 ]其中，所述重组表达载体是重组真核表达载体，优选为重组毕赤酵母表达载体;所 述的宿主细胞优选为酵母细胞，优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
[0022] 本发明技术方案与现有技术相比具有W下有益效果：
[0023] 本发明将果胶裂解酶优化基因转入到毕赤酵母中，该优化基因在毕赤酵母中的分 泌表达量显著提高，且所表达的果胶裂解酶能够有效地降解苹果中的果胶类物质，提高出 汁率，为进一步工业化扩大生产奠定了基础。
[0024] 本发明所设及的术语定义
[0025] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[00%]术语"重组宿主细胞"或"宿主细胞"意指包括外源性多核巧酸的细胞，而不管使用 何种方法进行插入W产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的 其他方法。外源性多核巧酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。 [0027]术语"多核巧酸"或"核巧酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核巧酸、脱氧核糖核 巧、核糖核巧或核糖核巧酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核巧酸 的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并W类似于天然产生的 核巧酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核巧酸类似物，其包括 PNA(肤核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代憐酸醋、憐酷胺酸醋等等）。除非另外指 定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取 代)和互补序列W及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个W上所选(或 所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌巧残基取代的序列来实现简并密码子取代 (Batzer等人，Nucleic Acid Res . 19:5081( 1991);Ohtsuka等人，J.Biol .Qiem. 260: 2605-2608( 1985);和Cassol等人，（1992) ;Rossolini等人，Mol Cell.ProbesS:91-98( 1994))。
[0028] 术语"表达"指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。
[0029] 术语"转化"指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。
[0030] 术语"外源基因"指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是 来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。
【附图说明】
[0031] 图1果胶裂解酶原始基因pnlzjSb密码子的使用频率。
[0032] 图2优化后果胶裂解酶基因pnlzj5b-m2密码子的使用频率。
[0033] 图3优化后果胶裂解酶基因pnlzj5b-m3密码子的使用频率。
[0034] 图4优化后果胶裂解酶基因pnlzj5b-m4密码子的使用频率。
[00对图5果胶裂解酶原始基因pnlzj化的mRNA二级结构图。
[0036] 图6优化后果胶裂解酶基因pnlz j5b-m2的