r>[0086] 首先采用平板筛选方法对转化子进行初筛。用无菌牙签将MD平板上长出来的转化 子复制到具有编号的MD平板上，将MD复制平板置于28°C培养箱培养，待平板上单菌落长好 后，按照编号接种到48孔平板中，每个孔中含有50化L BMGY，28°C，200r/min培养2d;400化/ min离屯、5min，弃上清，加入500化BMMY，28°C，200r/min培养3d;每12h补加一次甲醇（甲醇 终浓度为1%)。诱导结束后，40(K)r/min离屯、5min，收集上清，分别测定上清中果胶裂解酶的 活性。选取初筛酶活较高的菌株进行复筛，将活化好的菌株接种于IOml BMGY培养基中， 20化/min培养4她后，更换培养基为5ml BMMY，每12h按照1%的添加量补加一次100%的甲 醇。诱导72h后，离屯、收集酶液，用于测定凝乳酶活力。复筛结果进行再次重复试验，确认酶 活力。
[0087] 1.6果胶裂解酶重组毕赤酵母的发酵
[0088] W原始的果胶裂解酶重组毕赤酵母菌为对照菌株，分别将上述4株表达水平最佳 的毕赤酵母重组菌株进行实验室3升发酵罐水平诱导产酶发酵。
[0089] 分别将酵母转化子用无菌牙签挑到50mL YPD培养基中，摇床培养(28°C，200巧m) 4化后，转接到200ml YPD培养基中，摇床培养(28°C，200巧m)2地作为发酵种子菌液，接种于 3升发酵罐中。
[0090] 发酵罐参数设置为抑5.0，溫度30°C，揽拌速率为1000巧m，通气比为2:1，初始接种 量为200ml菌液，培养1加后开始流加葡萄糖（400ml的40%葡萄糖），补糖8h后，开始混饲 (100mL的40%葡萄糖+18ml甲醇），混饲4h后，开始流加甲醇诱导产酶，诱导期间通过调节甲 醇的补加流速，将发酵罐内溶氧水平控制在25%-50%之间，开始诱导后，每隔12h取发酵样 品测定菌体湿重和样品酶活并留样，酶活随着诱导时间的延长而增加，当酶活开始下降时， 停止发酵。将发酵液离屯、（10000巧111，1〇111111，4°(：)，收集上清酶液。
[0091] 2、试验结果
[0092] 分别筛选了转果胶裂解酶原始基因（pnlzjf5b)和优化基因（pnlzjf5b-m2，pnlzj5b-1113，口]1山^'化-1114)的酵母转化子各100株，各转化子的阳性率均在43%-46%之间。其中，妇居选 出转pn 1Z j 5b的酶活最高的菌株，其在摇瓶分泌表达的果胶裂解酶酶活性为4.2U/mL相应 的，转pnlz巧b-m2的菌株最高酶活为6.7U/mL，转pnlz巧b-m3的菌株最高酶活为2. lU/mL，转 pnlz巧b-m4的菌株最高酶活为4.4U/mL。转pnlzj加-m2的菌株的酶活明显高于转pnlzjSb、 pnlz j5b-m3、pnlz j5b_m4 的菌株。
[0093] 从化水平发酵结果可W看出，转原基因的酵母转化子pnlzjSb在甲醇诱导12化后 果胶裂解酶的活性为150U/mL，而转pnlzj5b-m2的酶活诱导12化后则达到了 532U/mL，是野 生型的3.5倍。但突变基因911^^'513-1113发酵水平仅为451]/1111，较野生型降低了70%; pnlz巧b-m4的发酵水平为171U/ml，较野生型提高了 14% (图10)，与野生型无显著差异。
[0094] 试验例3果胶裂解酶酶学性质测定
[0095] 1.1果胶裂解酶的纯化
[0096] 先将发酵液上清1000化pm离屯、lOmin，去除菌体沉淀，上清酶液采用PA化公司切向 流膜过滤系统进行浓缩，首先采用0.1 wii微滤膜进行过滤，W除去上清酶液中残留的细胞碎 片和可能存在的杂质，收集滤过液。然后将滤过液再经过截留分子量为IOkDa的超滤膜进行 过滤，弃去滤过液，得到浓缩的酶液。浓缩酶液经过阴离子交换层析和凝胶过滤进行纯化， 最终得到了纯化重组蛋白（图11)。
[0097] 1.2重组酶P化ZJ5B在苹果汁中的应用
[0098] 新鲜棒取的苹果汁在43°C用重组果胶裂解酶处理比后，其粘度下降28.02%，光穿 透率提高64.7%，出汁率提高了58.24%。说明果胶裂解酶P化ZJ5B能够有效地降解苹果中 的果胶类物质。对于苹果出汁率的影响，从表3中可W看出：在使用酶量一致的条件下，运些 果胶酶都能够降低苹果汁的粘度和澄清果汁，但果胶裂解酶PNLZ巧B所得果汁量最高，且明 显高于果胶酸裂解酶化、商品果胶裂解酶CPNL、商品聚半乳糖醒酸酶NPG和商品果胶醋酶PE 所得果汁量，说明裂解酶P化ZJ5B对于提高苹果汁的出汁率及其澄清效果有明显的优势;通 过比较，还可看出果胶裂解酶PNLZ巧B处理果汁所得果渣量少于聚半乳糖醒酸酶作用产生 的果渣。
[0099] 表3果胶裂解酶P化ZJ5B与其他不同的果胶酶在苹果汁中的应用a [01001
[0101] a添加酶量为IU的各果胶酶到50ml的苹果汁中，在43°C保溫比；
[0102] b用滤纸过滤处理过的苹果汁，计算在4min内苹果汁的出汁量;每个组都做S个平 行
[0103] 综上所述，黑曲霉来源的果胶裂解酶经多种策略的基因序列优化后，多个优化基 因中，口11山巧6-1112(56〇10^.2)能够显著提高该酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，而其 他优化基因经优化后仍不能提高表达水平(pnlz巧b-m3)，甚至下降（pnlz巧b-m4)。与国内 外已知研究比较，本实验得到的pnlzj5b-m2果胶裂解酶优化基因在毕赤酵母中的分泌表达 量达到较高表达水平，为进一步工业化扩大生产奠定了基础。
【主权项】
1. 果胶裂解酶优化基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或 SEQIDNO.^/f*。2. 按照权利要求1所述的果胶裂解酶优化基因，其特征在于:所述核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示。3. 含有权利要求1或2所述果胶裂解酶优化基因的重组表达载体。4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体是重组真核表 达载体。5. 按照权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组真核表达载体是重组酵 母表达载体;优选的，所述重组真核表达载体是重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载 体。6. 含有权利要求3-5任何一项所述重组表达载体的宿主细胞。7. 按照权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于:所述的宿主细胞为酵母细胞;优选的， 所述的宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。8. 权利要求1或2所述的果胶裂解酶优化基因在制备果胶裂解酶中的应用。9. 按照权利要求8所述的应用，其特征在于，包括:将权利要求1或2所述的果胶裂解酶 优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体;将所述重组表达载体转化宿主 细胞，得到重组菌株;培养重组菌株，诱导重组果胶裂解酶的表达，回收并纯化所表达的果 胶裂解酶。10. 按照权利要求9所述的应用，其特征在于:所述的重组表达载体为重组真核表达载 体，优选为毕赤酵母表达载体;所述的宿主细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)〇
【专利摘要】本发明公开了果胶裂解酶优化基因及其表达载体和应用。本发明首先在不改变果胶裂解酶氨基酸序列的前提下，通过包括密码子使用频率和分布,密码子适应指数CAI，改变特定基因区域的GC含量等多种序列优化方式，得到3个果胶裂解酶优化基因。进一步本发明将上述3个果胶裂解酶基因和1个野生型基因转入到毕赤酵母中进行表达，最终筛选出在毕赤酵母中的分泌表达量显著提高、酶活力最强的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的果胶裂解酶优化基因。本发明果胶裂解酶优化基因所表达的果胶裂解酶能够有效地降解苹果中的果胶类物质，提高出汁率，为进一步工业化扩大生产奠定了基础。
【IPC分类】C12N15/81, C12N1/19, C12R1/84, C12N15/60
【公开号】CN105695492
【申请号】CN201610179466
【发明人】张宇宏, 张伟, 刘波, 徐欣欣, 秦星
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月25日