一种聚合级乳酸单体生产菌及其构建方法与乳酸制造技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物应用领域，尤其是一种聚合级乳酸单体生产菌及其构建方法与 乳酸制造技术。
【背景技术】
[0002] 生物可降解材料是指其使用后的废弃物能够被环境(微)生物所降解和利用的一 类新颖材料。新一代生物可降解材料W聚乳酸为代表，分为聚心乳酸和聚D-乳酸，分别通过 其单体k乳酸或D-乳酸聚合而得。预计到2020年，全球聚乳酸的年需求量将达到1500万吨， 并且是年需求达5,000万吨的聚对苯二甲酸乙二醇醋。〇17日1：115^16]16 16'6地1：11曰1曰16,阳1') 和聚苯乙締(Polystyrene, PS)的最可能的替代品。
[0003] W高品质D-乳酸为原材料聚合而成的聚D-乳酸材料可W很好的替代普通化工产 品聚合而成的纤维、塑料等制品。特别是在高端消费品领域，如尿不湿内置垫片，香烟过滤 头等材料加工聚合方面，其独特的生物质材料特性、生物体相容性和无毒无害特性大幅度 提升相关产品的品质，市场空间巨大。W聚D-乳酸为原料采用3D打印技术制造的新产品具 备环保、机械性能良好、安全性等多重优点，被广泛应用于汽车、一次性用品、电子、医疗等 领域。更加值得关注的是极高光学纯D-乳酸和k乳酸加工聚合而成的高品质聚乳酸(PLA) 与同样生物可降解的下二酸下二醇醋-己二酸下二醇醋共聚物(PBSA)混纺可W大幅提高生 物可降解材料的强度和初性，拓展相关产品的应用领域。目前己斯夫等公司已经完成了PLA 与PBSA混纺产品的试制，并成功推出了一系列性能优良的新型生物可降解材料，相关进展 大幅度增加了极高光学纯D-乳酸和k乳酸的市场需求。
[0004] 米根霉，嗜热乳杆菌等传统乳酸生产菌株由于其自身特性和所需培养基复杂等特 点导致所产乳酸光学纯度无法满足聚合级的要求而不能用于极高光学纯D-乳酸和k乳酸 的规模化生产。重组酵母和重组大肠杆菌具备极高光学纯D-乳酸和k乳酸合成能力，且具 备营养要求低，易于高密度培养，工业化规模推广容易的优点，成为极高光学纯D-乳酸和k 乳酸生产菌株的研究热点。与重组酵母，经过多重遗传修饰过的大肠杆菌，能够合成极高光 学纯度和极高化学纯度的乳酸，并且由于大肠杆菌培养溫度显著高于酵母，重组大肠杆菌 用于乳酸发酵生产的周期较重组酵母大为缩短。因此，重组大肠杆菌被认为是工业化规模 下生产极高光学纯度D-乳酸和k乳酸最理想的菌株。
[0005] 特别是近年来，大肠杆菌作为D-乳酸生产菌种得到广泛的认可。当大肠杆菌同样 可W用于高光学纯度心乳酸的发酵生产时，对于D-乳酸和心乳酸在同一条生产线上的交替 生产意义重大。而且运也有助于高品质乳酸单体及聚乳酸制造业的快速发展。
[0006] 围绕重组大肠杆菌作为生产菌株用于极高光学纯D-乳酸的发酵生产已经进行了 多项成效显著的研究（Zhou L.et al.,Current Microbiology,2011,62:981-989;Zhu Y.et al.,Applied Environmental Microbiology,2007,73:456-464;Zhou S.et al., Applied Environmental Microbiology ,2003,69:399-407;Zhu J.et al.,Applied Microbiology and Biotechnology ,2004,64:367-375;Zhu J.et al.,Metabolic Engineering,2005,7:104-115;Bunch P.K.et al.,Microbiology,1997,143:187-195)。 如，I)严格厌氧发酵提高产酸效率化i et al., Ap plied Microbiology and Biotechnology，2002，60 :101-106); 2)停止通风条件下的低揽拌限氧发酵提高产酸效率 (Zhou L.et al., Qirrent Microbiology,2011,62:981-989) ;3)维持微好氧发酵条件提高 产酸效率(Tian K et al. ,2012
[0007] African Journal of Biotechnology , 11 (21):4860-4867；Zhou L et al., Biotechnology letters 2012,34:1123 1130) ;4)采用适宜培养溫度菌体生长和亚适宜生 长溫度限制菌体生长提高发酵产酸效率（Niu D et al. ,Microbial Cell Factories 2014,13:78-88;Zhou L et al.,Metabolic Engineering,2012,14:560 568);5)通过菌体 生长和发酵产酸采用不同碳源的方式提高发酵产酸效率等（Zhu L et al. ,Applied Environmental Microbiology,2007,73:456-464).
[000引发明人前期获得的授权专利（中国专利，专利号：ZL201210102731.8)则通过基因 转录水平上引入溫度调控元件，并配合发酵溫度调控策略大幅度提高了D-乳酸的合成效 率。本发明在此基础上通过引入菌体生长定量控制调控机制，形成了菌体生长过程和D-乳 酸合成过程的双开关机制，进一步提高了 D-乳酸合成效率。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题在于提供了一种聚合级乳酸单体生产菌。
[0010] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供了上述聚合级乳酸单体生产菌的构建 方法。
[0011] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供了应用上述聚合级乳酸单体生产菌的 乳酸制造技术，具体来说，是结合菌种代谢生长及产酸过程的特性和工业化规模生产的特 点形成的低成本易实施的微生物法极高光学纯乳酸单体高效制造技术。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0013] -种用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌，菌株保藏号为 CGMCC No. 11059(是实施例中菌株编号为B0013-090B的菌株）。
[0014] -种用于发酵生产极高光学纯レ乳酸的聚合级乳酸单体生产菌，菌株保藏号为 CGMCC No. 11060(是实施例中菌株编号为B0013-101J的菌株）。
[0015] 上述用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌和用于发酵生产 极高光学纯心乳酸的聚合级乳酸单体生产菌分别具备形成极高光学纯度D-乳酸和极高光 学纯度k乳酸的能力，光学纯度可W高于99.9%，所述D-乳酸和心乳酸的光学纯度特征均 可W满足高品质聚乳酸聚合过程对乳酸单体光学纯度的最高要求。
[0016] 上述用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌和用于发酵生产 极高光学纯k乳酸的聚合级乳酸单体生产菌分别具备形成高化学纯度D-乳酸和高化学纯 度心乳酸的能力，化学纯度可W高于99%，所述D-乳酸的和心乳酸的化学纯度特征经过简 单的后续处理甚至不处理可W满足高品质聚乳酸聚合过程对乳酸单体化学纯度的最高要 求。
[0017] 上述用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌和用于发酵生产 极高光学纯心乳酸的聚合级乳酸单体生产菌的构建方法为：
[001引单个或多个基因被敲除进行菌株初步构建，运些基因包括:I化A，thiE，dld，ackA， pta，pps，pf IB，poxB，frdA，adhE，1 IdD ;单个或多个基因被表达，运些基因包括：4曰]1- cI*?857-pR-pL-ldhA, IdhBcoa, Idhica, Idhstrb ；
[0019] 使用了溫度诱导型基因转录方式来控制和调节细胞生长过程和乳酸形成过程，包 括:菌株初步构建后，菌株在25-50°C条件下分阶段完成细胞发酵培养-诱导-产酸，细胞生 长过程在单一发酵因子调控下可W定量控制细胞的积累量，所述单一发酵因子是细胞中央 代谢途径关键酶转录过程的调控因子、关键酶翻译过程的调控因子、关键酶分泌过程的调 控因子或关键酶表达后催化过程调控因子。
[0020] 优选的，上述聚合级乳酸单体生产菌的构建方法，所述菌株积累量的定量控制可 W通过预先计算，在不同的发酵体系下添加一定量的单一发酵因子按照生产过程的实际需 求精确控制。
[0021] 优选的，上述聚合级乳酸单体生产菌的构建方法，菌株初步构建后菌株的生长过 程都与单一发酵因素的调控相关联，所述单一发酵因素可W是碳源，如葡萄糖、甘油；也可 W是单元如酵母膏、蛋白腺、硫酸锭、憐酸氨锭;也可W是金属离子，如铁离子、儀离子、巧离 子、锋离子、儘离子、钻离子、铜离子、钢离子、钟离子;也可W是营养元素，如VBl、VB6、VB12、 生物素、盐酸硫胺素、焦憐酸硫胺素，等等，特别是其中一种单一发酵因素可W定量的控制 细胞的积累过程，并保证细胞快速积累且具备高活性;可W W开关控制的方式启动或关闭 乳酸的合成过程，并且运一过程可W通过预先定量添加对应的发酵因素完成上述调控过 程。
[0022] -种乳酸制造技术，具体方法为:应用上述聚合级乳酸单体生产菌，所述菌株的宿 主细胞生长过程在全合成的无机盐培养基中快速进行，所述全合成的无机盐培养基为含硫 胺素的培养基，所述宿主细胞在全合成培养基中快速生长，其中，化发酵体系下于8-lOh内 菌体量积累到细胞干重11.5g/L，通过定量补加单一发酵因子，细胞干重进行更高积累，宿 主细胞培养过程中不大量形成乳酸，即乳酸的痕量形成不影响细胞生长，宿主细胞在生长 完成后快速积累乳酸。
[0023] 优选的，上述乳酸制造技术，D-乳酸和k乳酸的积累过程通过更换相应聚合级乳 酸单体生产菌在同一套生产体系下切换式进行。
[0024] 上述全合成培养基中有机物的添加不影响上述细胞高密度培养的过程，但不添加 有机物更有利于上述细胞高密度培养过程的进行。
[0025] 优选的，上述乳酸制造技术，所述全合成的无机盐培养基主体成分如下：
[00%]用于D-乳酸发酵生产的发酵培养基(g/L):憐酸氨二锭0-25,憐酸二氨钟0-5,憐酸 氨二钢0-25,氯化钢〇-5，MgS〇4 0-0.5，FeS〇4 0-1 ,FeCb 0-1，CoCl2 0-1，CuCl2 0-1， Na2Mo〇4 0-1，出B03 0-l，MnCl2 0-1，巧樣酸0-25,硫胺素0-1，木糖0-50,甘油0-50,葡萄糖0-50,硫酸0-5,抑 6.0-7.5。
[0027] 用于k乳酸发酵生产的发酵培养基(g/L):憐酸氨二锭0-25,憐酸二氨钟0-5,憐酸 氨二钢0-25,氯化钢〇-5，MgS〇4 0-0.5，FeS〇4 0-l，FeCl3 0-l，CoCl2 0-l，CuCl2 0-l，ZnCl2 〇-l，Na2Mo〇4 0-1，出B03 0-l，MnCl2 0-1，巧樣酸0-化，硫胺素0-1，木糖0-50,甘油0-50,葡萄 糖0-50,硫酸0-5,抑 6.0-7.5。
[0028] 所述的发酵产酸过程具备可设定型的自动启动特征，通过培养基组分和菌种自身 生长特性的组合，细胞生长至特定阶段后由于培养基中对应调控因子组分的含量变化自动 启动产酸过程。
[0029] 优选的，上述乳酸制造技术，所述菌株的生长过程W及乳酸形成过程都与发酵溫 度的过程相关联，发酵产酸过程在非固定溫度下完成的，根据生产菌种产酸特性，其发酵溫 度的变化呈现梯度上升的趋势，且存在一定组合方式下，溫度对产酸过程的影响最显著，产 酸效率最高，如:发酵溫度升高生长会变缓慢，而发酵溫度降低生长会非常迅速，具备积累 高活性细胞的特点;发酵溫度升高乳酸会快速形成，而发酵溫度降低乳酸会缓慢形成，甚至 不形成，具备高效积累乳酸的特点。
[0030] 优选的，上述乳酸制造技术，所述菌株先在25-36°C下利用葡萄糖快速生长形成菌 体，然后在37-50°C下利用葡萄糖快速积累乳酸。
[0031] 由于菌株在较低的溫度下，如25-36°C，D-乳酸和k乳酸合成关键酶编码基因1化A 和BcoaLDH的转录被强烈抑制；而在较高溫度下，如37-50°C，D-乳酸和k乳酸合成关键酶编 码基因1化A和BcoaLDH的转录被强烈启动，由此可见，菌株在生长的溫度和形成乳酸的溫度 可W是单一溫度下的持续过程，也可W是多个溫度点梯度式的组合过程。更优先使用多个 溫度点梯度式的组合过程。
[0032] 优选的，上述乳酸制造技术，具体步骤为：
[0033] (1)通过基因工程技术对D-乳酸和心乳酸高产重组菌染色体上的乳酸脱氨酶编码 基因的表达进行简易条件下的动态调控获得产酸菌株；
[0034] (2)将菌株在25-36 °C、200r/min好氧生长6-1 Oh，再在37-45 °C静置培养发酵乳酸， 并W出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物 及其它有机酸产物等，确定乳酸合成诱导时机；菌株分别在添加0.06-100yg/L硫胺素、 20化/min进行摇瓶培养；
[0035] (3)发酵生产极高光学纯D-乳酸时，限氧阶段0-化发酵溫度为33-39°C ,3-加发酵 溫度为37-42°(：，6-1化发酵溫度为38-451：，10-1611发酵溫度为40-481：，16-2地发酵溫度为 45-50 °C。
[0036] (3'）发酵生产极高光学纯レ乳酸时，限氧阶段发酵溫度为37-50°C，其余同步骤 (3)。
[0037] 优选的，上述乳酸制造技术，还包括发酵结束后乳酸的提取方法，结合生产菌种基 因工程改造后的特征，发酵液中D-乳酸和レ乳酸均W极高光学纯度和化学纯度的形式存 在，全合成培养基的使用保证了后提取过程的简洁型，其最终产品的提取方式包括酸化，板 框去除菌体，超滤去除色素和杂蛋白，离子交换去除阴阳离子干扰，浓缩制备相应浓度的产 品，并纳滤精制广品等环节。
[0038] 优选的，上述乳酸制造技术，所述乳酸形成过程结束后通过低溫酸化的方式将D-乳酸和k乳酸游离出来，且上述乳酸游离的过程不受发酵液中其他残余物的影响，酸化使 用的酸可W是硫酸，也可W是盐酸或草酸，更优选使用硫酸。
[0039] 上述乳酸制造技术，所发酵生产的极高光学纯D-乳酸和レ乳酸过程耗时不多于 30-36h，产D-乳酸和k乳酸水平分别达到150g/L和180g/L或W上，D-乳酸和k乳酸光学纯 度均在99.95W上，化学纯度均在97% W上。
[0040] 上述乳酸制造技术，还包括具有类似反应过程的其他化学品，如巧樣酸、甲酸、乙 酸、丙酬酸、下二酸、苹果酸、a-酬戊二酸、下二酸、己二酸、戊二胺、己二胺、甲基丙締酸、异 戊二締、衣康酸等多种有机酸和有机胺;或脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸 等多种氨基酸;硫胺素、维生素 Bi2等多种微生物;或乙醇、丙醇等短链醇;或低聚异麦芽糖、 低聚果糖、低聚半乳糖等多种功能糖等等。
[0041] 本发明的有益效果是：
[0042] 本申请在化201210102731.8所述通过基因转录水平上引入溫度调控元件，并配合 发酵溫度调控策略大幅度提高了 D-乳酸的合成效率的基础上，通过引入菌体生长定量控制 调控机制，形成了菌体生长过程和D-乳酸合成过程的双开关机制，进一步提高了D-乳酸合 成效率;本发明中所述极高光学纯k乳酸产生菌充分利用了外源心乳酸脱氨酶翻译表达后 的酶学特性，并引入了其催化活性的溫度调控机制，配合菌体生长定量控制的调控机制，完 成了菌体生长和心乳酸合成的双开关控制。
[0043] 更为突出的是，本发明中所述极高光学纯D-乳酸生产过程和极高光学纯k乳酸生 产过程可W通过菌种的简单切换在同一生产体系下完成两个产品的规模化生产。
[0044] 具体有益效果如下：
[0045] 1、本发明提供的重组菌具有明显的高效合成极高光学纯D-乳酸和k乳酸的能力， 同时上述重组菌具备的合成高化学纯度D-乳酸和k乳酸的能力。菌种在25-5(TC的条件下 细胞快速生长8-1 Oh，发酵产酸16-1化，产D-乳酸水平达到15% (w/v)或W上，产心乳酸水平 达到18% (w/v)或W上；
[0046] 2、本发明的高效合成极高光学纯乳酸单体基因工程菌，在菌体培养过程中，采用 全合成培养基，培养液澄清，有利于后续产品分离提取；
[0047] 3、本发明的高效合成极高光学纯乳酸单体基因工程菌，在菌体生长和发酵产酸过 程可W通过溫度变化有效控制；
[0048] 4、本发明的高效合成极高光学纯乳酸单体基因工程菌，在菌体生长和发酵产酸过 程可W通过营养元素的添加定量控制和开关控制
[0049] 5、本发明的极高光学纯乳酸单体高效制造过程:菌体细胞生长溫度在25-36°C下 利用葡萄糖快速生长6-12h，形成菌体;在37-5(TC下利用葡萄糖快速合成极高光学纯D-乳 酸和k乳酸。即：运用本发明的重组菌及其极高光学纯乳酸单体制备工艺，生产过程仅需改 变发酵溫度控制参数并配合营养元素的添加，即可实现极高光学纯D-乳酸和k乳酸的高效 制备过程。
【附图说明】
[0050] 图1突变盒质粒pUC-1化Ap: :kan-clt巧57-邮-PL的物理图谱；
[0051 ]图2突变盒质粒pUC-thiE' ： ：difGm的物理图谱；
[0化2]图3突变盒质粒pUC-dld' ： ：difGm的物理图谱；
[0化3] 图4突变盒质粒pUC-ackA-p化' ：：difGm的物理图谱；
[0054] 图5突变盒质粒pUC-pps' ： ：difGm的物理图谱；
[0055] 图6突变盒质粒pSK-pflB' ： ：difGm的物理图谱；
[0化6] 图7突变盒质粒pUC-poxB' ： ：difGm的物理图谱；
[0057] 图8突变盒质粒pSKsym-frdA' ： ：difGm的物理图谱；
[0化引图9突变盒质粒pUC-a化E' ： ：difGm的物理图谱；
[0059] 图10突变盒质粒pUC-1化A: :difGm的物理图谱；
[0060] 图11突变盒质粒pUC-11邮' ：=PidhA-I化Bcoa-difGm的物理图谱；
[0061 ] 图12突变盒质粒pUC-11邮' ：=PidhA-I化Lca-difGm的