物理图谱；
[0062] 图13突变盒质粒pUC-11邮' ：=PidhA-I化strb-difGm的物理图谱，
[0063] 图14突变盒质粒pUC-1化A' ： =PidhA-I化Lca-difGm的物理图谱；
[0064] 图15突变盒质粒pUC-1化A' ： =PidhA-I化strb-difGm的物理图谱；
[0065] 图16突变盒质粒pUC-thiE' ： =PidhA-I化Lca-difGm的物理图谱；
[0066] 图 17突变盒质粒pUC-thiE' ： =PidhA-I化strb-difGm的物理图谱。
[0067] 图18突变盒质粒pUC-thiE'： =PidhA 1化Bcoa-difGm的物理图谱。
[0068] 图19极高光学纯D-乳酸产生菌株筛选结果；
[0069] 图20极高光学纯k乳酸产生菌株筛选结果；
[0070] 图21极高光学纯D-乳酸发酵产生进程；
[0071] 图22 D-乳酸光学纯度检测图谱；
[0072] 图23极高光学纯k乳酸发酵产生进程；
[0073] 图24 k乳酸光学纯度检测图谱。
[0074] 保藏信息
[00巧]分类名词：大肠埃希氏菌Escherichia Coli
[0076] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、
[0077] 保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 [007引保藏日期:2015年7月7日
[0079] 保藏号：CGMCC No. 11059
[0080] 参据的生物材料(株）：B0013-090B
[0081 ] 分类名词：大肠埃希氏菌Escherichia coli
[0082] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、
[0083] 保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0084] 保藏日期:2015年7月7日
[0085] 保藏号：CGMCC No. 11060
[00化]参据的生物材料(株）：B0013-101J
【具体实施方式】
[0087] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0088] 本发明提供一种极高光学纯D-乳酸和极高光学纯k乳酸高产菌株与构建方法及 极高光学纯D-乳酸和极高光学纯k乳酸高效制备工艺，菌体在25-36°C下利用葡萄糖快速 生长形成高活性细胞，然后在37-50°C下高效积累极高光学纯D-乳酸和极高光学纯k乳酸， 且所积累乳酸的化学纯度极高。其工艺特征是:25-5(TC的条件下，分别经过发酵培养菌体， 变溫高效产酸阶段，产D-乳酸水平达到15% (w/v)或W上，光学纯度99.9% W上，化学纯度 97 % W上;产心乳酸水平达到18 % (w/v)或W上，光学纯度99.9 % W上，化学纯度98 % W上。
[0089] 本发明设及的具体方法有：
[0090] 染色体基因整合技术:运用PCR(多聚酶链反应)从大肠杆菌基因组中扩增获得染 色体目标整合位点的上游及下游各50-700bp基因序列。将目的整合表达基因与抗性基因进 行连接，所获得的片段克隆入上述目标整合位点的上游和下游基因序列之间，形成目的基 因整合序列，如 1 化A: :kan-clts857-pi?-piL,thiE' ： ：difGm,dld' ： ：difGm,ackA-pta' ：： difGm,pps'：：difGm,pflB'：：difGm,poxB'：：difGm,frdA'：：difGm,adhE'：：difGm,ldhA'：： difGm,ll加' ：：PidhA-ldhBc〇a-difGm,lldD' ： ：PidhA-ldhLca-difGm,lldD' ： ：PidhA-ldhstrb-difGm,ldhA' ： ：PidhA-ldhLca-difGm,ldhA' ： ：PidhA-ldhstrb-difGm,thiE' ： ：PidhA-ldhLca-difGm，thiE' ： ：PidhA-l化strb-difGm，thiE' ： ：PidhA-l化BGoa-difGm。将上述基因整合序列单独 或两两组合或多个组合转化入大肠杆菌。在选择性培养基上选择培养出转化子。提取转化 子染色体DNA，用PCR对转化子的目的基因突变进行验证。发酵试验筛选最优的极高光学纯 D-乳酸高产菌如B0013-090B和极高光学纯k乳酸高产菌如B0013-101J。
[0091] 利用上述重组方法，按照W下步骤完成对动态调控D-乳酸重组菌的构建。
[0092] 1 研究菌种：大肠杆菌 B0013(Zhou L.et al. ,Curr Microbiol ,2011,62:981-989) O
[0093] 2利用基因整合技术，将步骤I所获得的出发菌种中的乳酸脱氨酶基因的启动子 1化Ap替换为阳-化启动子化ove C. A. et al.，Gene，1996，176:49-53)，并获得重组大肠杆菌 Io
[0094] 3利用基因整合技术，构建硫胺素憐酸合成酶（thiE)编码基因删除用突变盒 thiE' ： ：difGm，删除步骤2所获重组菌的thiE基因，获得重组大肠杆菌2。
[00M] 4利用基因整合技术，构建FAD依赖型D-乳酸脱氨酶(did)编码基因删除用突变盒 did' ： ：difGm，删除步骤3所获重组菌的did基因，获得重组大肠杆菌3。
[0096] 5利用基因整合技术，构建乙酸激酶(ackA)和憐酸转乙酷酶(P化)编码基因删除用 突变盒ackA-p化' ：：difGm，删除步骤4所获重组菌的ackA-p化基因，获得重组大肠杆菌4。
[0097] 6利用基因整合技术，构建憐酸締醇式丙酬酸合酶(PPS)编码基因删除用突变盒 PPS' ： ：difGm，删除步骤4和步骤5所获重组菌的PPS基因，获得重组大肠杆菌5和6。
[0098] 7利用基因整合技术，构建丙酬酸甲酸裂解酶（PflB)编码基因删除用突变盒 Pf 1B' ： ：difGm，删除步骤4,步骤5和步骤6所获重组菌的PflB基因，获得重组大肠杆菌7-10。
[0099] 8利用基因整合技术，构建丙酬酸氧化酶(poxB)编码基因删除用突变盒poxB' ：： difGm，删除步骤4,步骤5,步骤6和步骤7所获重组菌的PflB基因，获得重组大肠杆菌11-18。
[0100] 9利用基因整合技术，构建富马酸还原酶(frdA)编码基因删除用突变盒打dA' ：： difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6，步骤7和步骤8所获重组菌的frdA基因，获得重组大肠杆菌 19-34。
[0101] 10利用基因整合技术，构建乙醇脱氨酶（a化E)编码基因删除用突变盒adhE' ：： difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6，步骤7，步骤8和步骤9所获重组菌的a化E基因，获得重组大 肠杆菌35-66。
[0102] 11利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氨酶（1化A)编码基因删除用突变盒1化A' ：： difGm,删除重组菌B0013-070的1化A基因，获得重组大肠杆菌67。
[0103] 12利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氨酶基因（1化A)编码基因删除用突变盒 1化A' ： =PidhA-I化Lca-difGm，删除重组菌B0013-070的1化A基因，获得重组大肠杆菌68。
[0104] 13利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氨酶基因（I化A)编码基因删除用突变盒 1化A' ： =PidhA-I化strb-difGm，删除重组菌B0013-070的1化A基因，获得重组大肠杆菌69。
[0105] 14利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的心乳酸脱氨酶基因（11加)编码基因删除 用突变盒11邮' ：：PidhA-l化Bcoa-difGm，删除重组菌B0013-070和步骤11，步骤12W及步骤13 所获重组菌的11邮基因，获得重组大肠杆菌70-73。
[0106] 15利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的心乳酸脱氨酶基因（11加)编码基因删除 用突变盒11邮'：：？1化4-1化1。3-(11'6111，删除重组菌80013-070和步骤11，步骤12^及步骤13 所获重组菌的11邮基因，获得重组大肠杆菌74-77。
[0107] 16利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的心乳酸脱氨酶基因（11加)编码基因删除 用突变盒11邮'：：？1化4-1化1。3-(11'6111，删除重组菌80013-070和步骤11，步骤12^及步骤13 所获重组菌的11邮基因，获得重组大肠杆菌78-81。
[0108] 17利用基因整合技术，硫胺素憐酸合成酶(tME)编码基因删除用突变盒tME' ：： difGm，删除步骤11，步骤12,步骤13,步骤14,步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得 重组菌种82-96。
[0109] 18利用基因整合技术，硫胺素憐酸合成酶(tME)编码基因删除用突变盒tME' ：： PidhA-ldhLGa-difGm，删除步骤11，步骤12,步骤13,步骤14,步骤15和步骤16所获重组菌的 thiE基因，获得重组菌种97-111。
[0110] 19利用基因整合技术，硫胺素憐酸合成酶(tME)编码基因删除用突变盒tME' ：： PidhA-ldhstrb-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的 thiE基因，获得重组菌种112-126。
[0111] 20利用基因整合技术，硫胺素憐酸合成酶(tME)编码基因删除用突变盒tME' ：： PidhA-ldhBcna-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的 thiE基因，获得重组菌种127-156
[0112] 21将步骤4，步骤5，步骤6，步骤7，步骤8，步骤9，步骤10，步骤11，步骤12，步骤13， 步骤14，步骤15，步骤16，步骤17，步骤18，步骤19和步骤20所获得的重组菌种在30°C和45 °C、200r/min进行摇瓶培养，并W出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析赖氨酸脱氨酶比 活性，鉴定PR-PL启动子和thiE的功能，并筛选出最优菌种。
[0113] 22将步骤21所获得的最优菌种分别在25-36°C、200r/min进行摇瓶培养，并W出发 菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、乳酸、代谢主要中间产物及其它有机酸产物 等，确定菌体生长培养溫度。
[0114] 23将步骤21所获得的最优菌种在25-36°C、200r/min好氧生长-1化，再在37-45°C 静置培养发酵乳酸，并W出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、糖耗、乳酸产 率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定乳酸合成诱导时机。
[0115] 24将步骤最优所获得的最优菌种分别在添加0.06-100yg/L硫胺素、200r/min进行 摇瓶培养，并W出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、乳酸、代谢主要中间产物 及其它有机酸产物等，确定菌体生长硫胺素添加量。
[0116] 25将步骤20所获得的最优菌种在化-30,00化发酵罐中进行乳酸发酵试验。发酵过 程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。
[0117] 下面W具体实例对本发明技术方案作进一步详细说明。
[0118] 实施例1--突变盒I化A: :kan-clt巧57-邮-PL的构建
[0119] 用引物IdhAl和ldhA2 PCR扩增B0013染色体上的IdhA基因片段IdhA'，克隆入 PUC18载体，获得重组质粒pUC-1化A'。用引物PPLl和PPL2对质粒PPL451进行反向PCR扩增， 并与卡那霉素抗性基因片段(质粒PSKsymKm用SmaI酶切，胶回收966bp片段)进行连接，获得 重组质粒pPkKan。用引物PPL3和PPL4对质粒pPkKan进行PCR扩增，产物用EcoRI和EcoRV进 行双酶切，并与WpUC-I化A'为模板用引物Ec-RlAl和EC-R1A2进行反向PCR扩增并用EcoRI 进行酶切的产物连接，从而获得重组质粒pUC-1化Ap: :kan-clts857-邮-pL。所得重组质粒的 物理图谱如附图1所示。将重组质粒pUC-1化Ap: :kan-clt巧57-pR-piL用KpnI酶切，并胶回收 线性化质粒，用引物1化Al和1化A2进行PCR扩增，获得1化Ap: :kan-clt巧57-阳-PL基因片段。
[0120] 实施例2--突变盒thiE: :difGm的构建
[0121] WE. COli B0013染色体DNA为模板，ThiElp和化iE化为引物扩增获得长度为0.化b 的thiE基因部分序列。将此克隆入PUC18,获得重组质粒pUC-tME。将长度为1.2化的difGm 片段克隆入thiE中间的StuI位点，获得重组质粒pUC-thiE: : difGm。所得重组质粒的物理图 谱如附图2所示。将重组质粒pUC-tME: :difGm用Ap化I酶切，并胶回收线性化质粒，用引物 化iElp和化iE化进行PCR扩增，获得thiE: :difGm基因片段。
[0122] 实施例3--突变盒did: :difGm的构建
[012引 W菌株B0013染色体DNA为模板，用引物Dldl和Dld2 PCR扩增did'基因片段 (0.9kb)，PCR产物克隆于载体PUC18 SmaI位点，获得重组质粒pUC-dld'。用EcoRV酶切该重 组质粒，去除did '基因中部0.4化基因片段，并克隆入dif-Gm-dif片段，获得重组质粒口抓-dld' ： ：difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图3所示。将重组质粒pUC-dld' ： ：difGm用 EcoRI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物Dldl和Dld2进行PCR扩增，获得did' ： ：difGm基因 片段。
[0124] 实施例4--突变盒ackA-p1:a: : difGm的构建
[01巧]W菌株B0013染色体DNA为模板，用引物AckA-Ptal和AckA-Pta2 PCR扩增ackA-Pta '基因片段（2 . Skb)，PCR产物克隆于载体PUC18中，获得重组质粒pUC-ackA-pta '。用 EcoRV酶切该重组质粒，去除ackA-pta '基因中部2 .化b基因片段，并克隆入dif-Gm-dif片 段，获得重组质粒pUC-ackA-p化' ：：difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图4所示。将重组 质粒pUC-ackA-pta' ： ： difGm用KpnI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物AckA-Ptal和AckA-Pta2进行PCR扩增，获得ackA-p1:a' ： ：difGm基因片段。
[0126] 实施例5--突变盒PPS: :difGm的构建
[0127] W菌株B0013染色体DNA为模板，用引物Ppsl和Pps2 PCR扩增PPS基因片段 (2.3kb)，PCR产物克隆于载体pUC 18中，获得重组质粒pUC-ppS '。W质粒pUC-pps '为模板，用 引物1?^31和1?^32进行反向口0?扩增，去除口口3'基因中部2.1此基因片段，并克隆入山'-6111-dif片段，获得重组质粒pUC-pps ' ： ： difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图5所示。将重组 质粒pUC-pps' ： ：difGm用ApEiLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物化Sl和化s2进行PCR扩 增，获得PPs'：：difGm基因片段。
[0128] 实施例6--突变盒时IB: : difGm的构建
[0129] W大肠杆菌B0013染色体DNA为模板，Pf IBl和Pf 1B2为引物进行PCR扩增，其扩增产 物Pf 1B'克隆于载体pSK的EcoRV和SmaI位点(在运过程中PstI和EcoRr消失），获得重组质粒 pSK-pflB' JstI酶切重组质粒pSK-pflB'，补平并与pSK-EcdifGm中的difGm连接获得重组 质粒pSK-pflB' ： ：difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图6所示。重组质粒pSK-pflB' ：： 山'6111用4口曰1^酶切，并胶回收线性化质粒，用引物?門8巧阳巧82进行?0?扩增，获得时18'：： difGm基因片段。
[0130] 实施例7--突变盒poxB: : difGm的构建
[0131] 用引物化XB巧日化xB2扩增大肠杆菌的poxB基因片段，PCR产物克隆入质粒PUC18的 SmaI酶切位点获得重组质粒pUC-poxB'。该重组质粒用EcoRV酶切，克隆入dif-Gm片段获得 重组质粒pUC-poxB'：：difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图7所示。将重组质粒pUC-poxB' ： ：difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物化XB巧日化xB2进行PCR扩增，获得 poxB' ： ：difGm基因片段。
[0132] 实施例8--突变盒打dA: :difGm的构建
[0133] W菌株B0013染色体DNA为模板，用引物化dAl和FrdA2 PCR扩增打dA'基因片段 (1.化b)，PCR产物克隆于载体pSKsym SmaI位点，获得重组质粒pSKsym-frdA'。用PstI酶切 该重组质粒，去除打dA'基因中部1.3kb基因片段，用T4 DNA polymerase使PstI粘性末端平 滑化，并克隆入dif-Gm-dif片段，获得重组质粒pSKsym-frdA' ： ：difGm。所得重组质粒的物 理图谱如附图8所示。将重组质粒pSKsym-frdA' ： ：difGm用Ap化I酶切，并胶回收线性化质 粒，用引物化dAl和化dA2进行PCR扩增，获得打dA' ： ：difGm基因片段。
[0134] 实施例9--突变盒a化E: : difGm的构建
[0135] W菌株B0013染色体DNA为模板，用引物AdhEl和A化E2 PCR扩增adhE'基因片段 (1.4kb)，PCR产物克隆于载体PUC19 SmaI位点，获得重组质粒pUC-a化E '。用EcoRV酶切该重 组质粒，去除a化E'基因中部1化基因片段，并克隆入dif-