一种植物愈伤组织遗传转化和植物组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物愈伤组织遗传转化和植物组织培养方法，尤其涉及一种通过大豆下胚轴作为外植体，诱导产生大豆愈伤组织，在基因枪、超声波和表面活性剂辅助下进行农杆菌侵染，进而产生转基因大豆植株的方法。
【背景技术】
[0002]转基因技术广泛应用到大豆生物技术育种当中。当前很多实验室都是利用大豆子叶节外植体直接进行遗传转化操作，然而这种方法缺点也是非常明显，如转化效率低、工作量大、随机性强、嵌合体多，受大豆基因型限制，很多大豆品种不能作为转化的受体。利用大豆下胚轴诱导的愈伤组织进行遗传转化可以克服大豆子叶节外植体局限，虽然Polacco早在1976年(Polacco JC.1976.Nitrogen metabolism in soybean tissue culture.PlantPhys1l.,58:350-357)就发表了利用下胚轴诱导愈伤的方法，但没有再生成完整的植株，也没有用它来进行大豆的遗传转化。
[0003]在大豆的遗传转化过程中，农杆菌介导的遗传转化和基因枪直接轰击这两种方法被广泛使用，但农杆菌介导的愈伤组织转化存在侵染率低、分化胚状体畸形多以及再生完整植株困难等问题。基因枪直接轰击因为外源基因完整整合到大豆基因组中的几率很低、嵌合体高、筛选量大等原因现在已经很少使用。如何提高农杆菌侵染愈伤组织的效率，成为大豆遗传转化能否成功的关键。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于开发一种提高农杆菌侵染愈伤组织的效率的方法。
【发明内容】
[0005]有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提高农杆菌侵染愈伤组织的效率，以提高大豆遗传转化的成功率。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种大豆愈伤组织遗传转化方法。
[0007]在本发明的较佳实施方式中，该植物愈伤组织遗传转化方法包括以下步骤:
[0008]I)诱导产生植物愈伤组织；
[0009]2)利用基因枪轰击步骤I)中的愈伤组织产生所述微创伤口 ；
[0010]3)利用农杆菌在含有表面活性剂的侵染培养基中对步骤2)中的愈伤组织进行侵染，并利用超声波进行处理；
[0011]4)对侵染后的愈伤组织进行筛选分化和继代培养。
[0012]进一步地，基因枪轰击的参数为:金粉直径为Ιμπι、真空度为28英寸汞柱、压力为900psi以及轰击距离为9cm，金粉不包裹质粒。
[0013]优选地，将淡黄色的愈伤组织在无菌的滤纸上密集摆放成直径为l-2cm圆形，然后进行轰击。
[0014]进一步地，表面活性剂为SiIwet L-77，其浓度为0.01-0.03%o优选地，表面活性剂SiIwet L-77的浓度为0.02%。
[0015]进一步地，超声波处理的功率为60-240W，超声处理时间为1-3秒。优选地，超声处理的功率为120W，超声处理时间为2秒。
[0016]进一步地，上述植物为大豆，步骤I)包括，将大豆种子消毒及萌发，将萌发后的下胚轴从中间剖开，随后诱导产生愈伤组织。
[0017]优选地，挑选饱满、干净的大豆种子，用氯气消毒14-18小时。脐向下种入萌发培养基中，24°C暗培养，萌发5天。切出5mm下胚轴，从中间剖开，使其平的一面贴在诱导培养基上，24°C暗培养直至产生愈伤组织，愈伤组织每两个星期继代一次。
[0018]进一步地，步骤3)中的侵染为在侵染培养基中振荡培养20-40分钟，农杆菌选自EHA105、EHA101或LBA4404。优选地，所述振荡培养的时间为30分钟。
[0019]进一步地，步骤4)包括:先将侵染后的愈伤组织暗培养3天，在第一除菌培养基中清洗侵染后的愈伤组织3-5次，并在第一除菌培养基中培养1-2小时；随后在第二除菌培养基中振荡培养6-8天，转速为60r/min，光周期16h/天，温度25°C ;之后在筛选和分化培养基中进行筛选和分化，光照16h/天，温度25°C，每隔两周更换一次培养基。
[0020]进一步地，侵染培养基为:1/10XMS盐、B5维生素、3%蔗糖、2.8mg/L FeSO4.7H20、3.8mg/L Na2_EDTA、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、0.02%Silwet L-77和0.3mg/L IAA，pH值为5.4;
[0021]第一除菌培养基为:除去硝酸盐的MS盐、1mM NH4N03、30mM KN03、B5维生素、3%蔗糖、5mM天门冬酰胺、5mg/L 2,4-D,200mg//L头孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L万古霉素，pH值为5.7;
[0022]第二除菌培养基为:除去硝酸盐的MS盐、1mM NH4N03、30mM KN03、B5维生素、3%蔗糖、5mM天门冬酰胺、5mg/L 2，4-D、100mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀和50mg/L万古霉素，pH值为5.7;
[0023]筛选和分化培养基为:MS盐、B5维生素、6%的麦芽糖、0.5%活性炭、1311^/1筛选剂、100mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、50mg/L万古霉素和0.3 %植物凝胶，pH值为5.7。
[0024]本发明还提供了一种组织培养方法，包括如上所述的植物愈伤组织遗传转化方法，还包括步骤:将筛选分化后的愈伤组织进行生根、炼苗和移栽，培养成再生植株。
[0025]进一步地，将生根的植株炼苗3-5天，然后转移到灭菌过的蛭石+珍珠岩中，蛭石保持湿润状态，光照15-17h/天，温度23-27°C，待植株高度约为50-70cm左右时，光照变为10-13h/天，以促进其开花。优选地，转移到灭菌过的蛭石+珍珠岩(3:1)中，蛭石保持湿润状态，光照16h/天，温度为25°C，待植株高度约为60cm左右时，光照变为12h/天，甚至更短，以促进其开花。
[0026]本发明的一个优选实施例中，将大豆下胚轴作为外植体，诱导形成愈伤组织。在农杆菌遗传转化的过程中，利用基因枪制造微创伤口，在超声波和表面活性剂的辅助下，极大提高了农杆菌的侵染效率。在农杆菌对愈伤组织进行侵染时，超声波也会对愈伤组织造成微创伤，而且，微创伤的分泌物能更好的诱导农杆菌侵染，所以可以达到提高农杆菌的侵染效率的目的。
[0027]本发明的愈伤组织遗传转化和植物组织培养方法，通过基因枪、超声波和表面活性剂的结合使用，极大地提高了植物愈伤组织的遗传转化效率、减少嵌合体的发生，并且转化后代外源基因稳定遗传。此外，对愈伤组织的破坏小，植物细胞容易自我修复，所以再生植株比例高。该方法操作简单，遗传转化率高，效果显著，能够高效地获得大量的转基因植株，在植物育种或筛选中都有广阔的应用前景。
[0028]以下将对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例中使用的各种试剂均可通过商业购买获得。以下实施例中使用的基因枪为B1-Rad PDS1000/He(美国，B1-Rad公司)，具体操作程序按照B1-Rad TOS100/He使用说明书进行。
[0030]实施例1
[0031](I)种子挑选与消毒:挑选饱满、干净的“天隆I号”大豆种子，用氯气消毒16小时。
[0032](2)种子萌发:配置IL萌发培养基，灭菌后倒入25个培养皿。将消毒好的种子脐向下种入萌发培养基中，每个培养皿种10粒，用封口膜包好，24°C，暗培养，萌发5天。
[0033]其中，每升萌发培养基含有:1XB5盐、1XB5维生素、28mg FeSO4.7H20、38mg Na2-EDTA、20g蔗糖、3g植物凝胶。
[0034](3)诱导愈伤组织形成:从萌发的大豆中切出5mm下胚轴，从中间剖开，使其平的一面贴在诱导培养基上，24°C暗培养直至产生愈伤组织，愈伤组织每两个星期继代一次。
[0035]其中，每升诱导培养基含有:1XMS盐、1XB5维生素、30g蔗糖、0.5mg2，4_D(2，4_二氯苯氧乙酸)、0.5mg IAA(吲哚乙酸)、0.6g MES(2_吗啉乙磺酸)、0.3mg N6-异戊烯基腺嘌呤、2.5g植物凝胶，pH值为5.8。
[0036](4)基因枪轰击:待愈伤组织形成后，选取表面光滑，圆形粒状，淡黄色的愈伤组织在无菌的滤纸上密集摆放成直径为1.5cm圆形，放入培养皿中，