一种胭脂果色素提取工艺及应用

1.本技术涉及一种胭脂果色素提取工艺及应用，属于由天然原料制备的天然来源的着色剂技术领域。


背景技术：

2.胭脂果为蔷薇科稠李属植物，学名粗梗稠李（padus napaulensis），主要分布于印度、尼泊尔、锡金、不丹、缅甸、中国等温带地区。在中国，主要分布于云南省，但以野生为主，目前尚无人工引种栽培。
3.胭脂果成熟果实呈黑紫色，味酸，常与冰糖共熬煮或酿酒；酒色呈紫红，色彩浓郁、艳丽，甜中带酸，能强化脾脏、消食开胃。此外，据文献报道，胭脂果含有胡萝卜素、花青素、黄酮类、维生素c等多种生理活性物质，有增强机体免疫力、延缓衰老、抗癌等作用。
4.因此，科学工作者希望从胭脂果中提取胭脂果色素，并将其应用于食品工业中，以改善合成色素所存在的营养价值低、人体代谢中存在一定毒副作用的缺陷。但截至目前，世界范围内鲜少有胭脂果相关研究报道，国内外也未有关于胭脂果成分、胭脂果色素稳定性等方面的相关研究报道，这也导致胭脂果色素没有相关的应用报道。如何实现从胭脂果中获取无毒无害且具有较高营养价值和一定生物活性的天然色素，以及如何实现所提取天然色素的应用效果，是胭脂果应用中亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术首先提供了一种胭脂果色素提取工艺，该工艺提取的胭脂果色素光稳定性、温度稳定性以及ph稳定性俱佳，同时抗氧化活性良好。
6.具体地，本技术是通过以下方案实现的：一种胭脂果色素提取工艺，以干燥的胭脂果果肉为原料，加入乙醇溶液作为提取液，乙醇溶液的体积浓度为0-65 %且不取零值，在25-300:1 ml/g的液固比下，控制浸提温度为30-100 ℃，浸提时间为10-150 min，得到胭脂果色素。
7.采用上述工艺浸提得到胭脂果色素，所提取的胭脂果色素具有很好的稳定性，在室内，紫外光，灯光，黑暗；4 ℃，25 ℃；ph = 3，5，7，9条件下吸光度变化幅度小，稳定性好；可与人工合成色素胭脂红相媲美。
8.进一步的，作为优选：不同乙醇体积分数得到的胭脂果色素溶液的a*值与吸光度存在较大差异，故所述乙醇浓度（体积分数）为20-50 %。更优选的，所述乙醇浓度为35%。
9.从兼顾得率和色泽的角度出发，进一步分析了不同单因素条件下所得样品的a*值且其与吸光度的拟合度，我们发现：所述液固比为100-300:1 ml/g。所述浸提温度为90-100 ℃。所述浸提时间为60-90 min。
10.上述条件下获得的胭脂果色素溶液的a*值与吸光度高度拟合。
11.所述干燥温度为40-80 ℃。优选的，干燥前还包括预处理：将胭脂果果肉按照5-10:1 g/ml的料液比，加水800 w功率煮沸5 min，将有效改善胭脂果色素的a*值。
12.同时，我们还发现：除阳光直射、高温（≥75 ℃）、强碱（ph≥11）环境下，上述方法提取的胭脂果色素溶液的光稳定性、温度稳定性和ph稳定性可与人工合成胭脂红色素相媲美，并具有一定的抗氧化活性，因此，可将上述提取的胭脂果色素应用于食品、轻工业领域，适用温度4-50 ℃；ph = 3-9，可以用于下述两类产品：产品一：胭脂果色素用于蛋糕类食品的上色，过程如下：（1）取本案制备的胭脂果35 %乙醇提取液，置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏，于-20℃预冻后冷冻干燥，打粉，过60目筛，得到胭脂果色素固体粉末；（2）鸡蛋、白砂糖、低筋面粉、牛奶、泡打粉、色拉油按照常规比例备料；（3）将胭脂果色素、鸡蛋黄、低筋面粉、牛奶、白糖采用打蛋器搅拌至稠糊状；（4）鸡蛋清中加入白砂糖、泡打粉用打蛋器打发，倒入步骤（3）的产物中，搅拌均匀；（5）倒入烤模中，置于烤箱中烘焙，即可；上述过程中，鸡蛋、白砂糖、低筋面粉、牛奶、泡打粉、色拉油按照常规比例添加，胭脂果色素相对低筋面粉的添加质量比为1:3-1:15。
13.产品二：胭脂果色素作为红色素或棕红色素，用于酒类的上色，过程如下：（1）取本案制备的胭脂果色素，以白酒、果酒、啤酒等酒类为原料；（2）室温下，分别按照100:1-1:10的体积比（胭脂果色素:原料酒），进行胭脂果色素与原料酒的混合；（3）密封，即可。
附图说明
14.图1为经不同预处理后胭脂果样品的a*值；图2为浸提溶剂浓度对胭脂果色素提取率的影响；图3为液固比对胭脂果色素提取率的影响；图4为浸提时间对胭脂果色素提取率的影响；图5为浸提温度对胭脂果色素提取率的影响；图6为不同光照下胭脂果35 %乙醇提取液与人工合成胭脂红色素溶液的吸光度；图7为不同光照下人工合成胭脂红色素溶液的a*值；图8为不同光照下本案胭脂果35 %乙醇提取液的a*值；图9为不同温度下胭脂果35 %乙醇提取液与人工合成胭脂红色素溶液的吸光度；图10为不同温度下人工合成胭脂红色素溶液的a*值；图11为不同温度下本案胭脂果35 %乙醇提取液的a*值；图12为不同ph下胭脂果35 %乙醇提取液与人工合成胭脂红色素溶液的吸光度；图13为不同ph值下人工合成胭脂红色素溶液的a*值；图14为不同ph值下本案胭脂果35 %乙醇提取液的a*值；图15为胭脂果色素固体粉末与纯水不同添加比的外观状态示意图，图16为胭脂果色素固体粉末与纯水不同添加比的酒精含量柱状图；图15-16中：a为无水乙醇，b为35%酒精，c为胭脂果色素固体粉末与纯水按照添加
比为1:5的混合溶液，d为胭脂果色素固体粉末与纯水按照添加比为1:10的混合溶液，e为胭脂果色素固体粉末与纯水按照添加比为1:15的混合溶液。
具体实施方式
15.下述实施例中，以胭脂果鲜果为处理对象，-20 ℃贮藏备用。
16.1. 用到的试剂包括：糖蜜酒精（食品级），购自耿马南华华侨糖业有限公司；abts
+
、dpph自由基清除能力测定试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司；试验用水为纯水，利用上海矩源自动化科技有限公司二级反渗透水处理设备jys-500l制得。
17.2. 用到的仪器：exion lc system超高效液相色谱仪（sciex）；qtrap 6500
+
高灵敏度质谱（sciex）；waters uplc色谱柱（acquity uplc hss t3 1.8 μm 2.1*100 mm）；cm-5台式色差仪（日本美能达）；uv-1800pc型紫外/可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；hgzf-9053型台式电热鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；al204-ic万分之一天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；hr/t20mm冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。
18.3. 检测方法如下：基于对反应过程的分析，本案确定影响提取的单因素主要涉及到浸提溶剂、液固比、浸提时间和浸提温度。
19.（1）胭脂果浸提样品吸光度测定：各样品经适当稀释后，测定277 nm处的吸光度。
20.（2）胭脂果浸提样品a*值测定：使用cm-5台式色差仪（日本美能达），测量条件设定为：d65 光源、10
°
测定角、sce（排除镜面反射光），黑白版校正以后，测定各样品a*值。a*值代表红绿色调，正值代表红色度，负值代表绿色度；正值大小代表红色的鲜艳程度，a*值越大，颜色越红。
21.（3）胭脂果色素溶液的稳定性研究：以人工合成胭脂红为对照，吸光度、a*值为检测指标，考察胭脂果35 %浸提液对温度、光照、ph的稳定性。胭脂红色素溶液检测波长为508 nm，胭脂果色素溶液检测波长为277 nm。
22.（4）胭脂果色素溶液抗氧化性研究：按照abts
+
、dpph自由基清除能力测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）的操作说明，测定各样品abts
+
、dpph自由基清除能力，结果以trolox当量（trolox equivalent， te）表示，单位为 μg te/ g。
23.（5）酒精计法测定乙醇残留量：室温25℃，待测样品经静置排除气泡后，轻轻放入酒精计；再次静置至酒精计平稳，水平观测刻度示值，即为待测样品乙醇浓度，以%表示。
24.（6）数据处理与统计：所得数据采用graphpad prism 8软件进行统计分析，除特殊说明外，所有数据均为3次重复实验所得的平均值。
25.实施例1本实施例对胭脂果浸提前预处理情况进行实验，具体过程如下：（1）胭脂果解冻，流水清洗，去核得果肉；（2）按不加纯水（表2中的“/”）、5:1 g/ml、10:1 g/ml的料液比进行纯水添加，在800 w功率下煮5 min后，冷却至室温，同时准备不加热（表2中的“/”）的空白实验；（3）步骤（2）处理后的物料分别于40 ℃、60 ℃、80 ℃烘干打粉，过60目筛；
℃，浸提60 min，浸提过程中，以液固比作为自变量，并选择25:1 ml/g 、50:1 ml/g、100:1 ml/g、200:1 ml/g、300:1 ml/g为代表，以胭脂果色素浸提液吸光度为响应值，结果如图3所示。
37.由图3可知，液固比在200:1 ml/g以下时，随着液固比的增大，样品吸光度逐渐增大，几乎呈线性递增；当液固比增加到200:1 ml/g以上时，吸光度值趋于稳定。因此，综合提取效果与成本，液固比的优化范围为100:1 ml/g ~ 300:1 ml/g，并以200:1 ml/g ~ 300:1 ml/g时提取效果最为稳定。
38.实施例4本实施例对浸提过程中的浸提时间进行实验，过程如下：以实施例1预处理后的干燥胭脂果果肉为原料， 35 %乙醇为提取液，液固比为200:1 ml/g，浸提温度90℃，并选择10 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min作为代表，浸提时间作为自变量，以胭脂果色素浸提液吸光度为响应值，通过控制变量，进行单因素考察，确定浸提时间的因素水平，结果如图4所示。
39.由图4可知，60 min以下时，随浸提时间延长胭脂果色素溶液的吸光度显著增大；当超过60 min时，则趋于稳定，特别是当浸提时间达到90 min以后，吸光度增长几乎呈水平线形态；继续延长浸提时间至120 min、150 min甚至更长，吸光度相对90 min时差异不显著；因此，综合时间与成本效益，适宜将浸提时间选定在60 ~ 90 min之间。
40.实施例5本实施例对浸提过程中的浸提温度进行实验，过程如下：以实施例1预处理后的干燥胭脂果果肉为原料，35%乙醇为提取液，液固比为100:1 ml/g，浸提时间为60 min，以浸提温度作为自变量，并选择30 ℃、45 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃为代表，以胭脂果色素浸提液吸光度为响应值，结果如图5所示。
41.由图5可知，60 ℃以下时，吸光度随温度逐渐增大，但增加不显著；当温度超过60℃时，吸光度则随提取温度的升高而增加显著，并在90℃时达到0.75以上；当浸提温度超过90 ℃时达到拐点，此时，继续提高温度则吸光度增速不显著。因此综合效益与成本考量，适宜将浸提温度的优化范围为60 ℃ ~ 100 ℃，并以90 ℃ ~ 100 ℃浸提最为高效稳定。
42.实施例6以响应面试验优化胭脂果色素浸提条件，运用design-expert 12软件建立四因素三水平box-benhnken 中心组合，分别以a（乙醇体积分数，%）、b（液固比，ml/g）、c（提取时间，min）、d（提取温度，℃）四个因素各自选择三个水平，设计四因素三水平共二十九组试验，针对相应样品的吸光度进行方差分析，结果见表2。
43.其中，四个因素各自选择如下三个水平：a（乙醇体积分数，%）：20、35、50；b（液固比，ml/g）：100、200、300；c（提取时间，min）：30、60、90；d（提取温度，℃）：80、90、100。
44.表2：响应面设计方案及相应样品吸光度测定结果
。
45.运用design-expert 12软件，以表2中胭脂果色素吸光度为响应值，对a、b、c和d进行多元回归分析，得到胭脂果色素的回归方程：y=0.5886+0.0135a+0.0158b+0.0098c+0.0705d-0.015ab+0.0058ac-0.0058ad-0.0315bc-0.005bd+0.0102cd-0.056a
2-0.0233b
2-0.0495c
2-0.036d2。
46.方差分析结果见表3。
47.表3：胭脂果色素提取回归方程方差分析表
。
48.注：p ≤ 0.05，为显著，用“*”表示；p ≤ 0.01，为极显著，用“**”表示；p ＞ 0.05，为不显著。
49.表3中模型f值为65.80，p＜0.0001，失拟项p= 0.1805＞0.05，差异不显著，表明：模型预测值与实际值拟合度较好，r
2 = 0.9850、r2adj = 0.9701表明模型有意义，可信度较高，该模型可用于明确胭脂果色素提取工艺，并准确预估提取样品吸光度的变化趋势。同时从表3分析结果可知，因素a、b、c、d、bc、a2、b2、c2、d2均对胭脂果色素提取率有显著影响（p＜0.01），因素ab对胭脂果色素提取率有影响（p＜0.05）。从f值可知，各因素对胭脂果色素提取率的影响大小排序依次为：提取温度＞液固比＞乙醇体积分数＞提取时间。
50.根据回归方程建立各因素响应曲面图，并预测获得胭脂果色素的最佳浸提条件为：乙醇体积分数33.92 %，液固比224.41:1 ml/g，提取时间65.04 min，提取温度99.96 ℃。此条件下获得的胭脂果色素浸提液吸光度预测值为0.624。
51.对预测条件进行修正：乙醇体积分数35 %，液固比200:1 ml/g，提取时间65 min，提取温度100 ℃。此时胭脂果色素的吸光度测定值为0.625，与预测值相接近，相差0.001。
52.对上述最优提取条件得到的胭脂果色素进行光、温度、ph稳定性。
53.以人工合成色素胭脂红为对照，适当稀释胭脂果色素35 %乙醇提取液，调整吸光度至0.3~0.75范围内后，测定不同光（以室内光、紫外光、日光、白炽灯光和黑暗条件为例）、温度（以4 ℃、25 ℃、50 ℃和75 ℃为例）、ph（以ph=3、5、7、9、11为例）条件下吸光度和a*值，以评价胭脂果色素的光、温度、ph稳定性。
54.从图6、9、12可知，本案制备的胭脂果35 %乙醇提取液（即胭脂果色素）在室内，紫外光，灯光，黑暗；4 ℃，25 ℃；ph = 3，5，7，9条件下吸光度变化幅度小，稳定性好；在50 ℃、75 ℃、ph 11条件下，吸光度虽有变化但不显著；但阳光直射5 h后吸光度保存率为114.22%，变化大，较不稳定。
55.与人工合成色素胭脂红相比，胭脂果35 %乙醇提取液在上述条件下吸光波动幅度
更小，稳定性更好。胭脂果35 %乙醇提取液在5 h后吸光度保存率（吸光度保存率（%）=a/a0×
100%；式中：a 为不同环境条件处理后的吸光度；a
0 为处理前的吸光度）仍为103.41 %，较人工合成胭脂红色素（114.22 %）更稳定。但50 ℃条件下5 h后观察，胭脂果35 %乙醇提取液的保存率为101.37 %；相似地，在此条件下胭脂果35 %乙醇提取液比人工合成胭脂红色素更稳定。75 ℃条件下，胭脂果35 %乙醇提取液不如人工合成胭脂红色素，5 h后，胭脂果35 %乙醇提取液保存率为119.01 %，大于人工合成胭脂红色素。在强碱环境（ph = 11）中保存48 h后，胭脂果35 %乙醇提取液的吸光度较人工合成胭脂红色素变化较大，稳定性不如人工合成胭脂红色素，胭脂果35 %乙醇提取液的样品保存率为109.36 %，人工合成胭脂红色素溶液则为96.44 %。
56.从a*值来看（图7-8、10-11、13-14），本技术所制备的胭脂果35 %乙醇提取液颜色有波动，但变化不大，表现出良好的温度性。在室内、紫外光、灯光和黑暗条件下，胭脂果35 %乙醇提取液的a*值未有明显变化，且a*值的波动比人工合成胭脂红色素更小；但在阳光直射条件下胭脂果35 %乙醇提取液不稳定。在4 ℃、25 ℃、50 ℃条件下胭脂果35 %乙醇提取液的a*值的波动幅度比人工合成胭脂红色素更小、更稳定；但75 ℃条件下，其稳定性相较人工合成胭脂红色素弱。胭脂果35 %乙醇提取液在中性和酸性条件下稳定性与人工合成胭脂红色素相当，但在强碱环境中，稳定性弱于人工合成胭脂红色素。
57.因此，本案所制备胭脂果色素稳定应用的条件满足：除阳光直射、高温（≥75 ℃）环境、强碱（ph≥11）极端环境外，其稳定性可与人工合成胭脂红色素相媲美。
58.对上述最优提取条件得到的胭脂果色素进行抗氧化性的分析，主要为胭脂果色素的abts
+
和dpph自由基清除能力，结果表明：胭脂果35 %乙醇提取液的abts
+
清除能力为4.175
ꢀ±ꢀ
0.0025
ꢀµ
g te/g，dpph自由基清除能力为1.275
±
0.0024
ꢀµ
g te/g。可见：胭脂果色素35 %乙醇提取液具有一定的抗氧化活性。
59.根据上述稳定性、抗氧化性实验结果可以看出，上述提取的胭脂果色素在保存和使用胭脂果色素时要避开阳光直射、高温和强碱环境。
60.实施例7胭脂果色素用于蛋糕上色，过程如下：（1）取本案制备的胭脂果35 %乙醇提取液，置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏，于-20 ℃预冻后冷冻干燥，打粉，过60目筛，得到胭脂果色素固体粉末；（2）鸡蛋、白砂糖、低筋面粉、牛奶、泡打粉、色拉油按照常规比例备料；（3）将胭脂果色素、鸡蛋黄、低筋面粉、牛奶、白糖采用打蛋器搅拌至稠糊状；（4）鸡蛋清中加入白砂糖、泡打粉用打蛋器打发，倒入步骤（3）的产物中，搅拌均匀；（5）倒入烤模中，置于烤箱中烘焙，即可。
61.胭脂果为酸甜口味可食用资源，在产地作为水果或制作成果酒、果脯等进行交易；利用液质联用技术初步分析了胭脂果的主要物质成分，从中鉴定出黄酮类、萜类、生物碱、酚类、醌类等多种类别共700多种化合物（见表4），其中有多种色素类成分，如多酚类化合物、异戊二烯类化合物、酮类化合物和醌类化合物等，未见至毒有安全隐患物质。
62.表4：胭脂果果肉中的呈色成分
。
63.利用35 %乙醇提取胭脂果色素，提取所用乙醇为食品级糖蜜酒精，安全不至毒。
64.经35 %乙醇提取，得到胭脂果色素提取液后，置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏，于-20℃预冻后冷冻干燥，打粉，过60目筛，得到胭脂果色素固体粉末；所得胭脂果色素溶液溶于水后，肉眼观察为酒红色，随着稀释倍数增加，颜色从酒红色逐渐变淡呈黄色。推测在胭脂果色素溶液浓度较大时红色盖过了黄色，显酒红色，稀释后黄色逐渐显露。因此，将胭脂果色素固体粉末按1:3-1:15配制使用，色泽表现为红色、棕色至浅黄色（图15中c、d、e）。
65.进一步地以酒精计法测定了胭脂果色素乙醇残留量，结果如图15、16所示。根据图15中a、b和图16中a、b：纯乙醇，无色，乙醇含量确为100%，35%乙醇，无色，乙醇含量确为35%，表明测定方法可行；根据图15中c、d、e与图16中c、d、e，胭脂果色素粉末与纯水分别按1:5、1:10、1:15质量体积比配比后，颜色由红色、棕色至浅黄色，且乙醇含量分别为0、0、0，表明胭脂果色素粉末中无乙醇残留。
66.本案所应用的胭脂果色素原料无至毒成分，安全可用。
67.上述应用过程中，除蛋糕必备成分外，仅引入胭脂果成分，未引入影响安全性的因
素。不同添加比在不同程度上影响口感（酸甜度等）、色泽等感官风味。所制备的产品不仅满足食品安全性要求，而且与未添加胭脂果色素的蛋糕相比，该蛋糕具有水果甜酸风味。
68.实施例8胭脂果色素用于酒类的复配与上色，过程如下：（1）取本案制备的胭脂果35 %乙醇提取液作为胭脂果色素，分别与原料酒（包含白酒、啤酒、果酒）进行复配与上色；（2）室温下，分别按照100:1-1:10的体积比（胭脂果色素:原料酒），进行混合；（3）密封，即可。
69.上述不同比例，实现了从酒红色、棕红色、红棕色、黄橘色、橘黄色到浅黄色不同深浅颜色的上色，同时胭脂果色素的比例不同，对原料白酒也进行了一定的稀释，并带入果香和其特有的果味，适宜人群扩大。