本发明属于链球菌病免疫诊断、检测
技术领域：
，涉及一种链球菌即无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定及其试剂盒的制备方法。技术背景无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）是一种具有高毒力的革兰氏阳性菌，能感染多种淡水和海水鱼类，每年给世界水产养殖业带来数以亿计的损失，近几年在我国南方罗非鱼养殖区肆虐流行，由于生产上缺乏有效的诊断检测方法，致使罗非鱼无乳链球菌病没有得到有效监控和防治，给罗非鱼养殖造成了造成重大损失，严重阻碍了我国罗非鱼养殖业的发展。目前对无乳链球菌病诊断检测方法主要有：（1）常规的形态培养鉴定、生理生化鉴定等传统方法，这些传统的诊断检测方法通常精确度较低，耗时耗力（2）分子生物学检测方法，主要有PCR、LAMP等一些分子生物学方法，这些分子生物学方法虽然灵敏度高，但操作技术难度高，基层使用有一定的困难。（3）免疫学检测方法，免疫学的检测方面很多，有检抗体的，也有检抗原的，检抗体的如间接酶联免疫吸附试验，这种方法只能检到循环抗体，但不能区分现症感染和既往感染，因此不能对疫病做出准确的诊断。本发明利用我们制备和筛选鉴定的抗鱼源无乳链球菌的特异的3A9和4C12单克隆抗体建立一种新的罗非鱼链球菌病免疫诊断检测方法，即：双抗体夹心ELISA法的检测方法，本发明由于利用了针对罗非鱼无乳链球菌的特异的单克隆抗体，不仅可以直接检测病原进行现症诊断，而且由于单克隆抗体可大量的制备、质量容易控制，因此可进一步提高检测方法的稳定性、灵敏度和特异性。本发明为临床上诊断和检测罗非鱼源无乳链球菌病提供了一种新的方法，可用于罗非鱼无乳链球菌的检测、诊断和药物治疗评价等。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，为临床提供一种检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法，可为临床实际提供一种用于罗非鱼无乳链球菌的检测、诊断和药物治疗评价的新方法。本发明所述的检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，包被有3A9单克隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12和显色底物3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺（TMB）。本发明为达到上述目标，选择了专利申请人制备、筛选的3A9单克隆抗体作为包被抗体，所述单克隆抗体由保藏号为:CCTCCNO:C2014244的杂交瘤细胞生产，C2014244杂交瘤细胞保存在中国典型培养物保存中心。所述试剂盒中，包被有3A9单克隆抗体的多孔板、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12和显色底物3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺分别各自单独存放。进一步的：所述多孔板每孔包被3A9单克隆抗体浓度为2.0-200.0μg/mL。进一步的：所述试剂盒还包括显色底物3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺。进一步的：所述多孔板每孔包被3A9单克隆抗体的用量为100μL，浓度为10.0μg/mL。进一步的：所述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体为4C12，所述辣根过氧化物酶标记单克隆抗体4C12的制备方法为：1）按常规方法制备小鼠腹水单克隆抗体4C12，用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯小鼠腹水单克隆抗体4C12，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL，单克隆抗体4C12放置于-20℃环境下保存备用；2)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中；3)将步骤2）获得的溶液加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光搅拌15分钟；4)将步骤3）获得的溶液装入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4小时换液一次，期间换液3-5次；5)在步骤4）获得的溶液中加入20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG，冰浴避光搅拌2小时；6)将步骤5）获得的溶液加入0.1ml浓度为4mg/mlNaBH4液，混匀，再在4℃环境下放置2小时；7)将步骤6）获得的溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小时换液一次，期间换液3-5次；8)将步骤7）获得的溶液在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵，置于4℃环境下2小时；9)将步骤8）获得的溶液放入离心管内，用离心机3000rpm离心30min，弃去上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗1-2次，最后沉淀物溶于0.15MpH7.4的PBS中；10)将步骤9）得到的溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析，祛除铵离子后(用萘氏试剂检测)，12000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，即酶标4C12，酶标4C12分装后冰冻保存，用间接ELISA方法检测，酶标4C12的效价达1：6400，最适稀释工作浓度为1：1600。进一步的：本发明还提供了检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒制备方法，所述步骤如下：A．制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板用碳酸盐缓冲液制成的包被液将3A9单克隆抗体稀释为浓度10.0μg/mL的稀释液，所述包被液由Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，加双蒸水定容至1000mL制成，其在4℃条件下保存，然后将所述3A9单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，置于4℃环境下包被12-24小时，包被时间届满后，将质量浓度5%的脱脂奶粉溶液加入多孔板的各孔内，并在37℃进行封闭反应，封闭反应时间至少1-1.5小时，封闭反应结束后，用洗涤缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有3A9单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃；B.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体4C12按常规方法：用杂交瘤细胞制备小鼠腹水单克隆抗体4C12，用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL，单克隆抗体至-20℃保存备用；C.配备显色底物3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺；D．制备检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，所述辣根过氧化物酶HRP标记4C12步骤如下：步骤1）称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中；步骤2）在步骤1）获得的溶液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光搅拌15分钟；步骤3）在步骤2）获得的溶液装入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4小时换液一次，期间换液3-5次；步骤4）在步骤3）获得的溶液中加20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化辣根过氧化物酶的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(经正辛酸一饱和硫酸铵粗提的4C12和经ProteinG亲和层析纯化的4C12)，冰浴避光搅拌2小时；步骤5）将步骤4）获得的溶液加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时；步骤6）将步骤5）获得的溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小时换液一次，期间换液3-5次；步骤7）将步骤6）获得的溶液在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵，置4℃2小时；步骤8）将步骤7）获得的溶液置于离心管内，用离心机在3000rpm条件下离心30min，弃去上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗1-2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中；步骤9）将步骤8获得的溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，12000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，即酶标4C12，使用时，用磷酸盐缓冲液作1：1600倍稀释。进一步的：所述制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板时，所述3A9单克隆抗体稀释液的加入量为100µL/孔，所述辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体4C12稀释液的加入量为100µL/孔，所述质量浓度5%的脱脂奶粉溶液的加入量为100µL/孔。进一步的：所述洗涤缓冲液由以下成分组成：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL即制成洗涤缓冲液。所述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12，制备方法如下：按常规方法，用杂交瘤细胞制备小鼠腹水单克隆抗体4C12，该单克隆抗体由保藏号为：CCTCCNO:C2014248的杂交瘤细胞生产，C2014248杂交瘤细胞保存在中国典型培养物保存中心。所述4C12的保藏的培养物名称：一种产生抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉市，武汉大学；保藏日期：2015年1月7日；保藏编号：CCTCCNO：C2014248。用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL，单克隆抗体至-20℃保存备用。HRP标记4C12步骤如下：①称取5mg辣根过氧化物酶（HRP）溶解于1ml蒸馏水中。②于上述溶液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光搅拌15分钟。③将上述溶液装入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4小时换液一次，期间换液3-5次；④将上述溶液加20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(经正辛酸一饱和硫酸铵粗提的4C12和经ProteinG亲和层析纯化的4C12)，冰浴避光搅拌2小时。⑤将上述溶液加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时。⑥将上述溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小时换液一次，期间换液3-5次。。⑦将上述溶液在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵，置4℃2小时。⑧将上述溶液放入离心管中，用离心机3000rpm离心30min，弃去上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗1-2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。⑨将上述溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，12000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，即酶标4C12，使用时，用磷酸盐缓冲液作1：1600倍稀释。上述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C12相关试剂的配制：①0.1MNaIO4：称取241mg高碘酸钠溶于蒸馏水10ml中。②1mMpH4.4醋酸钠缓冲液:0.2MNaAc称取无水醋酸钠16.4g，加双蒸水200ml溶解，定容到1000ml。0.2MHAc量取11.55ml冰醋酸定容到1000ml。1mMpH4.4醋酸钠缓冲液：0.2MNaAc195ml加0.2MHAc305ml充分混匀。③0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液:Na2CO30.32gNaHCO30.586g加蒸馏水至50ml使用工作液再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01MpH9.5的碳酸盐缓冲液。④稀释缓冲液:0.15MpH7.4PBS：A.0.2mol/L的NaH2PO4：称取NaH2PO4·2H2O31.2g加蒸馏水至1000ml溶液；B.0.2mol/L的Na2HPO4：称取Na2HPO4·12H2O71.632g加蒸馏水至1000ml溶液；0.15MpH7.4PBS由292.5ml的A液加457.5mlB液充分混合，调节pH到7.4，并定容到1000ml。⑤NaBH4溶液(4mg/ml):临用时称取NaBH44mg溶于1ml蒸馏水中。本发明所述试剂盒及制备方法中，3A9单克隆抗体本质上为蛋白质，能特异识别无乳链球菌。所述3A9的保藏的培养物名称为：一种产生抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A9，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉市，武汉大学；保藏日期：2015年1月7日；保藏编号：CCTCCNO：C2014244。本发明所述检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，检测标本为感染动物（如罗非鱼）的血清及脑、肝、脾、肾组织浸出液，所需仪器为酶标仪，使用方法如下：在包被有3A9单克隆抗体的多孔板的孔中加入待检样品，37℃反应1小时后，洗涤液洗涤3次除去未反应物，加入HRP标记的单克隆抗体4C12，37℃作用1小时后洗涤除去未反应物，加入新鲜配制的3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺显色，室温显色时间为20分钟后加入终止液2mol/LH2SO450μL/孔终止反应，用酶标仪测所述多孔板各孔的OD450值。所述3A9的保藏的培养物名称为：一种产生抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A9，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉市，武汉大学；保藏日期：2015年1月7日；保藏编号：CCTCCNO：C2014244。所述4C12的保藏的培养物名称：一种产生抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉市，武汉大学；保藏日期：2015年1月7日；保藏编号：CCTCCNO：C2014248。本发明具有以下有益效果：1.本发明使用的识别无乳链球菌的单克隆抗体3A9是我们从制备的多个单克隆抗体中筛选鉴定出来的，因此使本发明所述试剂盒检测无乳链球菌特异性效果更好。2.使用本发明所述试剂盒进行无乳链球菌检测，操作方法简单，一个样品的检测只需5个小时左右。与传统的形态培养鉴定、生理生化鉴定等传统方法相比，使用本发明所述试剂盒可以进行早期诊断，而且具有更高的检测灵敏度。3.与常用的间接ELISA相比，使用本发明所述试剂盒，能区分现症感染和既往感染，能做出是否感染无乳链球菌的直接判断，还可用于临床无乳链球菌病治疗效果的评价。具体实施方式下面通过实施例对本发明所述检测无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）双抗体夹心酶联免疫吸附测定（doubleantibodysandwichELISA）试剂盒及制备方法和使用方法做进一步说明。下述实施例中涉及的材料来源和制备方法如下：3A9单克隆抗体和4C12单克隆抗体分别用3A9杂交瘤细胞株（保藏编号：CCTCCNO:C2014244）和4C12杂交瘤细胞株（保藏编号：CCTCCNO:C2014248）按常规方法制备;辣根过氧化物酶（HRP）、显色底物3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺、牛血清白蛋白均为Sigma公司产品；IgG为经正辛酸一饱和硫酸铵粗提的4C12其余常规试剂为国产分析纯级产品；各种试液配制：包被缓冲液配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加双蒸水定容至1000mL，4℃保存；封闭液配制：脱脂奶粉5.0g，加包被液定容至100mL。稀释缓冲液配制：称取KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.58g，NaCl8.0g，加三蒸水定容至1000mL，灭菌后4℃保存备用。洗涤缓冲液配制：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL。底物缓冲液配制：Na2HPO4·12H2O3.68g，柠檬酸0.93g，加三蒸水定容至100mL。3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺（TMB）母液配制：称取TMB（四甲基联苯胺）200mg，加入100mL无水乙醇溶解。显色液配制：取TMB母液500μL，底物缓冲液10mL，0.75%H2O232μL混匀。终止液配制：量取2M浓H2SO422.2mL，蒸馏水177.8mL混合（操作小心）。多孔板为市售96孔的酶标检测用多孔板。实施例1本实施例中，采用以下工艺步骤制备检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒。（1）制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板用碳酸盐缓冲液即包被液将3A9单克隆抗体稀释为浓度10.0μg/mL的稀释液，然后将所述3A9单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，置于4℃包被至少12小时，包被时间届满后，将质量浓度5%的脱脂奶粉溶液加入多孔板的各孔内，并在37℃进行封闭反应，封闭反应时间至少1小时以上，封闭反应结束后，用洗涤缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有3A9单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃。（2）制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体4C12按常规方法：用杂交瘤细胞制备小鼠腹水单克隆抗体4C12，用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL，单克隆抗体至-20℃保存备用。HRP标记4C12步骤如下：①称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。②于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光搅拌15分钟。③将上述溶液装入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4小时换液一次，期间换液3次。④加20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(经正辛酸一饱和硫酸铵粗提的4C12和经ProteinG亲和层析纯化的4C12)，冰浴避光搅拌2小时。⑤加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时。⑥将上述液装入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小时换液一次，期间换液3次。⑦在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵，置4℃2小时。⑧3000rpm离心30min，弃去上清。沉淀用半饱和硫酸铵洗1-2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。⑨将上述溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，12000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，即酶标4C12，使用时，用稀释缓冲液（同上）作1：1600倍稀释。（3）用底物缓冲液配制3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺底物显色液20000μL。所述显色底物3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺为市售商品，可直接从市场购买。上述方法中，制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板时，所述3A9单克隆抗体稀释液的加入量为每孔100μL，所述辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体4C12稀释液的加入量为100µL/孔，所述质量浓度5%的脱脂奶粉溶液的加入量为100µL/孔。本发明所述试剂盒及制备方法中，3A9单克隆抗体本质上为蛋白质，能特异识别无乳链球菌。本发明所述检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，检测标本为感染动物（如罗非鱼）的血清及脑、肝、脾、肾组织浸出液，所需仪器为酶标仪，使用方法如下：在包被有3A9单克隆抗体的多孔板的孔中加入待检样品，37℃反应1小时后，洗涤液洗涤3次除去未反应物，加入HRP标记的单克隆抗体4C12，37℃作用1小时后洗涤除去未反应物，加入新鲜配制的3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺显色，室温显色时间为20分钟后加入终止液2mol/LH2SO450μL/孔终止反应，用酶标仪测所述多孔板各孔的OD450值。用本实施例制备的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒对无乳链球菌和阴性血清进行检测，操作如下：将无乳链球菌和阴性血清用稀释缓冲液（同上）稀释成表1中的稀释倍数；用碳酸缓冲液（同上）将3A9单克隆抗体稀释为浓度10.0μg/mL的稀释液；将酶标4C12用稀释缓冲液（同上）作1：1600倍稀释；空白对照为稀释缓冲液（同上）。向包被有3A9单克隆抗体的多孔板的各列孔中分别加入不同稀释倍数的无乳链球菌、阴性血清和对照稀释盐缓冲液（PBS）。加入量为每孔100μL。在37℃反应1小时后，用洗涤液洗涤3次除去未反应物，加入HRP标记的单克隆抗体4C12，37℃作用1小时后洗涤除去未反应物，加入新鲜配制的3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺显色，室温显色时间为20分钟后加入终止液2mol/LH2SO450μL/孔终止反应，用酶标仪测所述多孔板各孔的OD450值。检测结果见表1：表1检测结果从表1的检测结果可以看出随着检测标本中无乳链球菌浓度的降低，OD450值也随之降低，空白对照的OD450值则远低于检测无乳链球菌的OD450值。实施例2与实施例1的不同在于用阴阳临界值（OD450平均值）作为判断检测样本中有无无乳链球菌的标准。本实施例中，采用以下工艺步骤制备检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒。（1）制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板用碳酸盐缓冲液即包被液（同上）将3A9单克隆抗体稀释为浓度10.0μg/mL的稀释液，然后将所述3A9单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，置于4℃包被至少12小时，包被时间届满后，将质量浓度5%的脱脂奶粉溶液加入多孔板的各孔内，并在37℃进行封闭反应，封闭反应时间至少1小时以上，封闭反应结束后，用洗涤缓冲液（同上）洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有3A9单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃（一般在4℃冰箱保存备用）。（2）制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体4C12按常规方法：用杂交瘤细胞制备小鼠腹水单克隆抗体4C12，用正辛酸一饱和硫酸铵法提纯，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测得单克隆抗体4C12的浓度为4.34mg/mL，单克隆抗体至-20℃保存备用。HRP标记4C12步骤如下：①称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。②于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光搅拌15分钟。③将上述溶液装入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4小时换液一次，期间换液5次。④加20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(经正辛酸一饱和硫酸铵粗提的4C12和经ProteinG亲和层析纯化的4C12)，冰浴避光搅拌2小时。⑤加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时。⑥将上述液装入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小时换液一次，期间换液5次。⑦在冰浴搅拌下逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵，置4℃2小时。⑧3000rpm离心30min，弃去上清。沉淀用半饱和硫酸铵洗2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。⑨将上述溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，12000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，即酶标4C12，使用时，用稀释缓冲液（同上）作1：1600倍稀释。（3）用底物缓冲液配制3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺底物显色液20000μL。所述显色底物3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺为市售商品，可直接从市场购买。上述方法中，制备包被有3A9单克隆抗体的多孔板时，所述3A9单克隆抗体稀释液的加入量为每孔100μL，所述辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体4C12稀释液的加入量为100µL/孔，所述质量浓度5%的脱脂奶粉溶液的加入量为100µL/孔。本发明所述试剂盒及制备方法中，3A9单克隆抗体本质上为蛋白质，能特异识别无乳链球菌。本发明所述检测无乳链球菌的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，检测标本为感染动物（如罗非鱼）的血清及脑、肝、脾、肾组织浸出液，所需仪器为酶标仪，使用方法如下：在包被有3A9单克隆抗体的多孔板的孔中加入待检样品，37℃反应1小时后，洗涤液洗涤3次除去未反应物，加入HRP标记的单克隆抗体4C12，37℃作用1小时后洗涤除去未反应物，加入新鲜配制的3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺显色，室温显色时间为20分钟后加入终止液2mol/LH2SO450μL/孔终止反应，用酶标仪测所述多孔板各孔的OD450值。用本实施例制备的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒对无乳链球菌和阴性血清进行检测，操作如下：将无乳链球菌和阴性血清用稀释缓冲液（同上）稀释成表1中的稀释倍数；用碳酸缓冲液（同上）将3A9单克隆抗体稀释为浓度10.0μg/mL的稀释液；将酶标4C12用稀释缓冲液（同上）作1：1600倍稀释；空白对照为稀释缓冲液（同上）。向包被有3A9单克隆抗体的多孔板的各列孔中分别加入不同稀释倍数的无乳链球菌、阴性血清和对照稀释盐缓冲液（PBS）。加入量为每孔100μL。在37℃反应1小时后，用洗涤液洗涤3次除去未反应物，加入HRP标记的单克隆抗体4C12，37℃作用1小时后洗涤除去未反应物，加入新鲜配制的3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺显色，室温显色时间为20分钟后加入终止液2mol/LH2SO450μL/孔终止反应，用酶标仪测所述多孔板各孔的OD450值。按照实施例2所述的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测操作方法，向包被有3A9单克隆抗体的多孔板的各列孔中分别加入阴性血清、阳性对照血清和空白对照（PBS，同上）检测样品，检测10份阴性血清样本，以及阳性对照血清和空白对照，每份重复3孔，结果见表2，计算出其OD450的平均值及标准方差分别为：平均值（X）为0.1484，标准差（S）为0.0201，空白对照的数值为0.088±0.001，根据公式X＋3S计算得：阳性和阴性的结果判断的临界值为0.21，即在阴阳性对照成立的情况下，OD450大于0.21就可以判定为无乳链球菌阳性，否则，判为阴性。表2阴性样本的测定结果Table5-5ResultsofDetectionthenegativesera样品号12345678910OD值0.1310.1250.1230.1560.1590.1640.1460.1510.140.189判断检测样本中无乳链球菌阴阳临界值（OD450平均值）的确定。按照实施例1所述的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测操作方法，向包被有3A9单克隆抗体的多孔板的各列孔中分别加入阴性血清、阳性对照血清和空白对照（PBS，同上）检测样品，检测10份阴性血清样本，以及阳性对照血清和空白对照，每份重复3孔，结果见表2，计算其OD450的平均值及标准方差。阴阳性临界值=阴性样本OD450平均值+3×标准方差。经计算阴性血清OD450平均值（X）=0.08427，标准方差（S）=0.015252。所以，阴阳性临界值=0.08427+3×0.015252=0.130因此把判断检测样本中大片吸虫抗原阴阳临界值定为0.130。用所述的检测大片形吸虫双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测样本时，在阴阳对照成立的情况下，OD450大于0.130就可以判定为大片吸虫抗原阳性，否则，判为阴性。表2阴性血清、阳性对照血清OD450值测定结果450血清样品平均值血清样品平均值10.085±0.00460.092±0.01620.092±0.00470.110±0.00130.085±0.01180.049±0.00440.074±0.00190.084±0.00250.085±0.006100.086±0.001空白对照Blank0.049±0.004阳性对照Positive1.501±0.089实施例3与实施例1和实施例2的不同在于用阴阳临界值（OD450平均值）来判断对无乳链球菌的特异性检测效果。按照实施例1所述的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测方法，检测无乳链球菌、鳗弧菌（Vibrioanguillarum）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、荧光假单胞菌（P.Fluorescens）、豚鼠单胞菌（Aeromonascaviae）、铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）和施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzer）并用SP2/0细胞（骨髓瘤细胞）作阴性对照，进行特异性验证测定，结果见表3。表3检测结果T菌液浓度（CFU/ml）1.5×108无乳链球菌1.021±0.072鳗弧菌0.088±0.007嗜水气单胞菌0.130±0.003荧光假单胞菌0.120±0.053豚鼠气单胞菌0.132±0.013铜绿假单胞菌0.123±0.009施氏假单胞菌0.115±0.017阴性对照0.121±0.043从表3的结果可以看出，无乳链球菌的OD450值为1.021±0.072，高于阴阳临界值（阴阳临界值为0.21），为阳性判断，而鳗弧菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、豚鼠单胞菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌检测到的OD450值都远低于阴阳临界值，证明用所述的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测鳗弧菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、豚鼠单胞菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌时，不与这些抗原发生交叉反应，说明所述的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒具有良好的检测特异性。实施例4与实施例1-3的不同在于用阴阳临界值（OD450平均值）来判断被检测不同临床样品中有无无乳链球菌。采用无乳链球菌回归感染的方法，用罗非鱼人工感染无乳链球菌,感染剂量为1.5×105CFU（每毫升样品中含有的细菌群落总数）/尾，感染12小时后采集感染罗非鱼的肝脏、脾脏，按照实施例1所述的检测无乳链球菌双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测方法检测30份肝脾的组织浸出液样本，结果见表4。从表4检测结果可知，按照实验确定的阴阳临界OD450值（见实施例2）为0.21，实验的阴阳对照和空白对照成立，在所检测的30份肝脾的组织浸出液样本，都能再肝脏或（和）脾脏检测到无乳链球菌，检测数据结果见表4。表4检测结果鱼编号肝组织浸出液OD450值脾组织浸出液OD450值10.8590.12220.2260.11531.1170.16840.3630.14850.3980.12860.1550.64370.1520.35980.1430.65290.2620.281100.1290.336110.4290.194120.0920.192130.1180.270140.2150.189150.1170.244160.0940.219170.3090.267180.8820.151190.0790.412200.0660.250210.0800.318220.1131.154230.0840.406240.0680.210250.8460.404260.2100.580270.1350.253280.1030.570290.1860.377300.1550.643阴性0.1050.145阴性0.1550.130本发明不局限于以上所述的具体实施方式，以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。当前第1页1 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