一种快速测定金霉素预混剂中金霉素含量的方法与流程

本发明属于分析测试
技术领域：
，具体涉及一种快速测定金霉素预混剂中金霉素含量的方法。
背景技术：
：金霉素(Chlortetracycline,CTC)是属于四环素类的一种广谱抗生素，在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途。近年来，四环素类抗生素在抗肿瘤、抑制骨形成等方面的研究，拓宽了这类产品在医药方面的应用范围。金霉素预混剂是金霉素生产菌的全发酵液与适量碳酸钙制成的金霉素钙盐，其中的药物成分主要是金霉素，但是，也含有一些相关的发酵副产物，如四环素等。目前药典中规定金霉素含量的检测方法主要采用的是微生物法和高效液相色谱法。微生物法测定金霉素含量的方法、操作繁琐、耗时长，且影响因素多、要求环境条件高，测试的准确度难以保证，测试的重复性与再现性也相对较差。《中国药典》公开了采用HPLC法检测盐酸金霉素含量及相关物质的具体操作，其中提供了两种不同的色谱条件：碱性流动相和酸性流动相，碱性流动相使用草酸铵、磷酸氢二铵及二甲基甲酰胺的混合溶液，用氨试液调pH为8.3，该方法虽然比微生物法方便、快捷，但是pH8.3的碱性流动相条件，金霉素在碱性条件下极不稳定，易氧化降解，而且流动相含有盐类，盐类容易结晶吸出，造成仪器系统配件磨损，缩短仪器的寿命；酸性流动相使用高氯酸、水和二甲亚砜混合溶液，高氯酸为强氧化性酸，易腐蚀仪器系统，缩短色谱柱及仪器的寿命。申请号CN201510431875.1，名称为《高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法》的专利改用水、磷酸、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液作为流动相，酸性较为温和，但是该方法仅在一定程度上缓解了结晶盐类磨损和强氧化性酸腐蚀的问题，并未根本解决，这种含磷酸的流动相长期使用势必也会腐蚀仪器系统，缩短仪器寿命。此外，高效液相色谱法的检测费用昂贵，样品预处理繁琐，不适用于大量检测，因此对于金霉素预混剂生产而言，需要一种快速、易行、准确可靠的检测方法。技术实现要素：本发明针对微生物法和高效液相色谱法存在的不足，提供一种快速测定金霉素预混剂中金霉素含量的方法。本发明采用如下技术方案：一种快速测定金霉素预混剂中金霉素含量的方法，包括以下步骤：S1、标准曲线的绘制1)盐酸金霉素标准曲线的绘制：取盐酸金霉素的标准品并配制成一系列效价梯度的标准溶液，每个效价设置多组标准溶液，取其中一组作为第一标准对照组，所述第一标准对照组用于校正的参比溶液，第一标准对照组的处理方式如下：加入n摩尔量的盐酸；其余各组作为第一标准实验组，所述第一标准实验组的处理方式如下：加入n摩尔量的盐酸后进行加热处理；测定各个第一标准实验组的吸光度并取平均值，然后根据平均吸光度与第一标准实验组效价的对应关系建立盐酸金霉素的标准曲线；2)盐酸四环素标准曲线的绘制：取盐酸四环素的标准品并配制成一系列效价梯度的标准溶液，每个效价设置多组标准溶液，取其中一组作为第二标准对照组，所述第二标准对照组用于校正的参比溶液，第二标准对照组的处理方式如下：加入体积VEDTA的EDTA混合液，静置后，再加入n摩尔量的盐酸；其余各组作为第二标准实验组，所述第二标准实验组的处理方式如下：加入体积VEDTA的EDTA混合液，静置后，再加入n摩尔量的盐酸，然后进行同S11)中的加热处理；测定各个第二标准实验组的吸光度并取平均值，然后根据平均吸光度与第二标准实验组效价的对应关系建立盐酸四环素的标准曲线；S2、金霉素预混剂样品溶液的配制1)将金霉素预混剂样品研磨后取M，经溶解处理使样品中的抗生素成分充分释放后，过滤取滤液，滤液体积为V0，即得V0的金霉素预混剂样品溶液；S3、金霉素预混剂样品溶液总效价的检测1)设置第一对照组和第一实验组，第一对照组和第一实验组各取V1的步骤S2所配制的金霉素预混剂样品溶液，第一对照组的处理方式同第一标准对照组，第一实验组的处理方式同第一标准实验组，第一对照组和第一实验组均用水稀释至相同体积V11；2)分光光度计检测：以第一对照组为参比溶液，校正后，测得第一实验组的吸光度A；3)计算：对照步骤S1所得盐酸金霉素的标准曲线，吸光度A对应于效价N1，则金霉素预混剂样品溶液的总效价R1＝N1×V11/V1；金霉素预混剂样品的总效价＝V0×R1/M；S4、金霉素预混剂样品溶液中四环素效价的检测1)设置第二对照组和第二实验组，第二对照组和第二实验组各取V2的步骤S2所配制的金霉素预混剂样品溶液，第二对照组的处理方式同第二标准对照组，第二实验组的处理方式同第二标准实验组，第二对照组和第二实验组均用水稀释至相同体积V22；2)分光光度计检测：以第二对照组为参比溶液，校正后，测得第二实验组的吸光度B；3)计算：对照步骤S1所得盐酸四环素的标准曲线，吸光度B对应于效价N2，则金霉素预混剂样品溶液中的四环素效价R2＝N2×V22/V2；金霉素预混剂样品中的四环素效价＝V0×R2/M；S5、金霉素预混剂样品中的金霉素效价RCTC＝V0×R1/M-V0×R2/M；S6、取多个不同金霉素含量的金霉素预混剂样品，经过步骤S1至S5分别测得金霉素效价RCTC，同时利用高效液相色谱法分别测定金霉素含量，然后将所得金霉素效价RCTC与高效液相色谱法检测的金霉素含量进行线性拟合，得到回归方程；S7、取待测金霉素预混剂样品，经过步骤S1至S5得到金霉素效价RCTC后，代入回归方程即得该待测金霉素预混剂样品中的金霉素含量。本发明的检测原理为：金霉素预混剂样品溶液中加入盐酸，其中的金霉素和四环素在酸性条件下，经加热水浴处理后脱去一分子水而生成黄色的脱水金霉素和黄色的脱水四环素，其颜色深度(对应于分光光度计中测得的吸光度)与效价成正比；本发明中所用的EDTA混合液由氢氧化钠和乙二胺四乙酸二钠溶于水中配制而成，因此EDTA混合液呈碱性，加入到金霉素预混剂样品溶液中，金霉素在碱性条件下转化为异金霉素，使金霉素失去在酸性条件下显色的性质，然后加盐酸使四环素在酸性条件下加热脱去1分子水而生成黄色的脱水四环素，其颜色深度(对应于分光光度计中测得的吸光度)与效价成正比基于以上原理，对标准溶液和金霉素预混剂样品溶液作出加盐酸和/或加EDTA混合液的处理，测定吸光度，通过标准溶液建立吸光度和效价的标准曲线，通过测定金霉素预混剂样品溶液的吸光度，对照标准曲线，得出金霉素预混剂样品溶液中金霉素和四环素的总效价以及四环素自身的效价，进而计算得到金霉素效价。最后将分光光度计所得金霉素效价与高效液相色谱法测得的金霉素含量进行线性拟合，得到回归方程，此后对于待测金霉素预混剂样品，只需测得金霉素效价，即可代入方程得到金霉素含量。本发明的有益效果如下：(1)仪器设备投入少，只需要一台分光光度计；(2)操作简便，避免了操作繁琐，减轻劳动强度；(3)试剂用量少，节约了检测试剂成本，且所用试剂对人和环境无毒害，减轻了污水处理负担；(4)样品处理及测定程序简单，便于实现快速检测，可一次性检测大量样品；(5)对于金霉素预混剂检测的准确度与重现性不低于高效液相色谱法，适合于企业日常生产的连续检测，准确可靠且经济实惠。附图说明图1为步骤S6中的线性拟合图；图2为盐酸金霉素的紫外-可见吸收光谱图。具体实施方式为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明。一种快速测定金霉素预混剂中金霉素含量的方法，包括以下步骤：S1、标准曲线的绘制1)盐酸金霉素标准曲线的建立精确吸取效价为1000u/mL的盐酸金霉素标准溶液各0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL于七组50mL的容量瓶中，每组3只容量瓶，分别加入2mol/L的盐酸溶液5mL，其中一只容量瓶加蒸馏水稀释定容、摇匀，作为参比溶液，即第一标准对照组；另两只进行100℃、5min的水浴处理，冷却后加蒸馏水稀释定容、摇匀，作为第一标准实验组，测试后取平均值；在分光光度计上选波长440nm，用参比溶液校正，用1cm比色皿，以参比溶液作空白对照测得上述7组中第一标准实验组的吸光度并取平均值，以效价为纵坐标，以平均吸光度为横坐标，建立盐酸金霉素标准曲线；2)盐酸四环素标准曲线的建立精确吸取1000u/mL盐酸四环素标准溶液各0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL于七组50mL容量瓶中，每组3只容量瓶，分别加入EDTA混合液11mL，室温静置5min，然后分别加入2mol/L的盐酸溶液5mL，其中一只容量瓶加蒸馏水稀释定容、摇匀，作为参比溶液，即第二标准对照组；另两只进行100℃、5min的水浴处理，冷却后加蒸馏水稀释定容、摇匀，作为第二标准实验组，测试后取平均值；在分光光度计上选波长440nm，用参比溶液校正，用1cm比色皿，以参比溶液作空白对照测得上述7组中第二标准实验组的吸光度并取平均值，以效价为纵坐标，以平均吸光度为横坐标，建立盐酸四环素标准曲线；所用EDTA混合液的配制方法如下(下同)：分别称取分析纯氢氧化钠55克、乙二胺四乙酸二钠4.55克于烧杯中，加200mL蒸馏水溶解后，稀释至5000mL，保存于试剂瓶中，备用；S2、金霉素预混剂样品溶液的配制1)将金霉素预混剂样品利用粉样器研磨成粉状并取Mg于50mL容量瓶中，少量多次加入浸泡剂后并平摇，无气泡产生后定容，然后超声波水浴20min，通过浸泡剂和超声波水浴处理充分促进金霉素和四环素的溶解，取出冷却至室温，上述溶解处理的作用在于使样品中的抗生素成分充分释放，然后过滤取滤液，滤液体积为V0＝50mL，即得V0＝50mL的金霉素预混剂样品溶液；所述浸泡剂由水、丙酮和5mol/L的盐酸按照1000：500：80的体积比混合配制而成；所得金霉素预混剂样品溶液中金霉素预混剂样品的浓度为0.004～0.007g/mL；S3、金霉素预混剂样品溶液总效价的检测1)设置第一对照组和第一实验组，第一对照组和第一实验组各取V1＝0.5mL的步骤S2所配制的金霉素预混剂样品溶液于两只50mL容量瓶中，且各加入2mol/L盐酸5mL，第一对照组加水稀释定容、摇匀，第一实验组进行100℃、5min中的水浴处理后，冷却，加水稀释定容、摇匀，V11＝50mL；2)分光光度计检测：以第一对照组为参比溶液，在波长440nm处校正后，测得第一实验组的吸光度A；3)计算：对照步骤S1所得盐酸金霉素的标准曲线，吸光度A对应于效价N1，则金霉素预混剂样品溶液的总效价R1(u/mL)＝N1×V11/V1＝100N1；金霉素预混剂样品的总效价(u/g)＝V0×R1/M＝50×R1/M；S4、金霉素预混剂样品溶液四环素效价的检测1)设置第二对照组和第二实验组，第二对照组和第二实验组各取V2＝1mL的步骤S2所配制的金霉素预混剂样品溶液于两只50mL容量瓶中，且各加入11mL的EDTA混合液，室温静置5min后，第二对照组和第二实验组再各加入2mol/L的盐酸5mL，然后第二对照组加水稀释并定容、摇匀；第二实验组进行100℃、5min中的水浴处理后，冷却，加水稀释定容、摇匀，V22＝50mL；2)分光光度计检测：以第二对照组为参比溶液，在波长440nm处校正后，测得第二实验组的吸光度B；3)计算：对照步骤S1所得盐酸四环素的标准曲线，吸光度B对应于效价N2，则金霉素预混剂样品溶液中的四环素效价R2(u/mL)＝N2×V22/V2＝50N2；金霉素预混剂样品中的四环素效价(u/g)＝V0×R2/M＝50×R2/M；S5、金霉素预混剂中的药成分主要为金霉素和四环素，所以金霉素预混剂样品中的金霉素效价RCTC＝V0×R1/M-V0×R2/M＝50×(R1-R2)/M；S6、取多组不同金霉素含量且不同重量的金霉素预混剂样品(金霉素含量从13％、15％、20％、22％、25％不等)，经过上述步骤S1至S5测得多组吸光度A和B，并计算得到对应的R1、R2和RCTC，同时利用高效液相色谱法测得每组金霉素预混剂样品的金霉素含量，然后将所得金霉素效价RCTC与高效液相色谱法检测的金霉素含量进行线性拟合，以分光光度计检测的金霉素效价RCTC为横坐标，高效液相色谱法检测的金霉素含量为纵坐标，做直线回归和相关性分析，绘制线性拟合图如图1所示，并得到回归方程：金霉素含量＝-6.570+0.9851×RCTC，相关系数R-Sq＝99.8％。所述多组金霉素预混剂样品的检测数据如表1所示。S7、取待测金霉素预混剂样品，经过步骤S1至S5得到金霉素效价RCTC后，代入回归方程即得待测金霉素预混剂样品中的金霉素含量。表1多组金霉素预混剂样品的检测数据汇总注：样品编号括号中的百分比指金霉素预混剂样品中金霉素含量的质量比；效价单位g/kg＝103u/g。本发明选择在波长440nm处校正，原因在于：经紫外-可见分光光度计检测(见图2、表2)，盐酸金霉素在440nm处有最大吸收峰，故取440nm进行校正。具体的检测方法如下：(1)配制1000u/mL盐酸金霉素标准溶液，从中各吸取1mL标准溶液于两只50mL容量瓶中，分别加入5mL2mol/mL的盐酸，其中一只加蒸馏水定容、摇匀，作为参比溶液，另一只于100℃水浴加热5分钟，取出冷却至室温，加水定容、摇匀；(2)采用752N型紫外-可见分光光度计，开机预热20分钟，在不同波长处测上述溶液的吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标得到的吸收谱图如图2所示，吸收数据统计如表2所示：表2盐酸金霉素标准溶液的紫外-可见吸收数据波长(nm)240400410420430436438440442444446448450吸光度0.000.0050.1530.2300.2720.2860.2880.2900.2890.2880.2870.2800.277波长(nm)452454456458460470480490500510520860--吸光度0.2730.2680.2590.25402460.1950.1400.0880.0650.0400.0230.000--最后所应说明的是：上述实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，任何对本发明进行的等同替换及不脱离本发明精神和范围的修改或局部替换，其均应涵盖在本发明权利要求保护的范围之内。当前第1页1 2 3