技术特征：
1.一种基于催化酶激活的靶向交联剂在蛋白分析中的应用，其特征在于：所述的靶向交联剂为c3-c20烷基链二端具有活性基团的有机物；一端活性基团为过氧化物酶激活的苯酚基团，另一端活性基团为可控光反应基团的双吖丙啶基团、三氟甲基双吖丙啶基团、苯基三氟甲基双吖丙啶基团中的一种；作为连接臂的c3-c20烷基链上含有可富集基团如生物素、炔基、叠氮基团中的一种或二种以上；1)将靶向交联剂用有机溶剂配成溶液，加入至细胞培养液中，将细胞培养液加入细菌、真菌或细胞中孵育后，加入过氧化氢溶液进行自由基反应激活后加入淬灭溶液，接着光照引发光反应；2)交联反应完成后，用缓冲液清洗细菌、真菌或细胞，收集细菌、真菌或细胞，进行蛋白提取；3)加入分体式富集试剂，使交联蛋白修饰上富集臂；进行蛋白沉淀，去除多余未反应的富集试剂；4)采用ph为1-6.5的酸性缓冲溶液或ph为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂和/或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；5)加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解；6)向步骤(5)的酶解产物中加入富集材料；7)使用盐溶液或表面活性剂洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；8)使用洗脱溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶，进行质谱分析和数据检索。2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中的一种或二种以上，交联剂浓度为1μm-1m；步骤(1)中所述的细胞培养液为常用培养液细胞培养液rpmi-1640，dmem，f12培养基等中的一种，细菌真菌培养液为lb培养液，高氏一号培养基，tb培养基等中的一种；所用细胞为线粒体表达过氧化物酶或细胞核表达过氧化物酶，或egfr蛋白表达过氧化物酶等通过构建克隆的方法将过氧化物酶与细胞器靶向肽或其中蛋白融合的细胞系中的一种；交联剂的终浓度为10nm-100mm；孵育10-60分钟；过氧化氢终浓度为0.5-10mm，处理时间为30s-5min；淬灭溶液为含1-50mm抗坏血酸钠、1-50mm trolox、1-50mm叠氮化钠的缓冲盐溶液，淬灭处理时间为30s-5min；光激发波长为光反应基团所需波长，为254nm或365nm；光照处理时间为10s-10min；步骤(1)和(2)中缓冲液为ph为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上。3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述收集细胞的过程为胰酶消化或细胞刮消化或离心收集得到的细胞样品；步骤(2)中所述蛋白提取采用细胞裂解的方法，细胞裂解方法为机械裂解或反复冻融法等裂解方法中的一种或二种以上；上述机械裂解方法，于细胞中加入蛋白酶抑制剂即pmsf、antipain、抑肽酶、edta等中的一种或多种后；使用匀浆器、超声仪、研钵或组织捣碎机等对组织或细胞样品进行裂解。4.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(3)所述分体式富集试剂为c3-c20烷
基链二端具有活性基团的有机物，一端活性基团为炔基或叠氮基团，一端活性基团为生物素，作为连接臂的c3-c20烷基链上含有可断裂基团如的偶氮基团、二烷氧基二苯基硅烷、二硫键基团中的一种；步骤(3)中所述的蛋白沉淀方法包括甲醇沉淀、丙酮沉淀或甲醇氯仿沉淀法。5.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(4)中所述的蛋白质样品溶解液中，ph为1-6.5的酸性缓冲溶液，由甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液配制而成；所述的ph为7.5-14的碱性缓冲缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；所述的蛋白质溶解液中，所述的表面活性剂包括以下三类中的任一一类：1)十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、烷基糖苷、100(聚乙二醇辛基苯基醚)(triton x-100)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(chaps)、rapigest sf或乙基苯基聚乙二醇(np-40d)中的一种或二种以上，质量体积浓度按表面活性剂的质量(以g为单位)与缓冲溶液的体积(以ml为单位)之比计为0.1％-30％；2)离子液体：阳离子部分为烷基链部分含2个以上碳的烷基，烷基链连接有咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子中的一种或二种以上；阴离子部分为卤素离子、no
3-、clo
4-、alcl
4-、bf
4-、pf
4-、cf3coo-、cf3so
3-、(cf3so2)2n-或sbf
6-中的一种或二种以上的离子液体；质量体积浓度按离子液体的质量(以g为单位)与碱性缓冲溶液的体积(以ml为单位)之比计为0.1％-30％；3)尿素、硫脲或盐酸胍等去垢剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按去垢剂的物质的量与缓冲溶液的体积之比计为0.1-20m；所述的有机溶剂为c3-c10有机醇类或c3-c10有机酸类中的一种或二种以上，体积浓度按有机溶剂与缓冲溶液的体积之比计为0.1％-100％；所述的还原剂为二硫苏糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦(tcep)或β-巯基乙醇等还原剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按还原剂的物质的量与缓冲溶液的体积之比计为0.1-1000mm；所述的高温孵育法，具体为将蛋白质提取液在40-100℃水浴下孵育1min-10h。6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(5)中所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种，溶于上述缓冲溶液后的摩尔浓度为1-200mm；所述的蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶k、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-c/n、蛋白内切酶glu-c/n、asp-c/n中的一种或二种以上，使用二种以上时，选用的酶可同时使用或顺序使用，蛋白酶与蛋白质的质量比为1:500
–
500:1。7.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(6)中所述的富集材料为基质上带有富集基团的材料，富集基团为可与交联剂上的基团如亲和素高特异性结合的如亲和素、链霉亲和素等中的一种或二种以上；所述富集材料的基质为琼脂糖凝胶球、磁球、peg聚合物球等有机/无机材料中的一种或二种以上；步骤(7)中所述的清洗溶液为下述中的一种或二种以上：浓度为0.1-8m的氯化钠溶液、0.1-8m的氯化钾溶液、0.1-1m的碳酸钠溶液、2-10m的尿素溶液、1-8m的盐酸胍溶液或10-1000mm的碳酸氢铵溶液；乙腈、甲醇、异丙醇；十二烷基磺酸钠、triton x-100、chaps、
tween；步骤(8)中所述的洗脱溶液为水或缓冲溶液或有机试剂配制而成的，包含可切割权利要求4步骤3)中断裂基团的试剂，如采用连二亚硫酸钠溶液还原偶氮基团、采用甲酸溶液断裂二烷氧基二苯基硅烷基团、采用二硫苏糖醇还原二硫键基团等中的一种或二种以上，缓冲溶液或有机试剂如权利要求2中所述。8.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌、真菌或细胞为通过构建克隆的方法将过氧化物酶与细胞器靶向肽或其中蛋白融合的细胞系中的一种。9.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，在过氧化物酶的催化下，实现对特定蛋白质区域的快速靶向交联反应，进而提供该空间区域时空动态的蛋白质相互作用信息；可实现化学交联反应在特定亚细胞器或特定蛋白质纳米区域范围内中的靶向、可控激活。
技术总结
本发明涉及一种基于催化酶激活的新型靶向交联剂，实现化学交联反应在特定亚细胞器中的靶向、可控激活，从而进行亚细胞器靶向的蛋白质复合物原位分析。该方法可在细胞原位水平上，实现在特定亚细胞器中或目标蛋白质区域范围内的的靶向性化学交联反应，从而进行亚细胞器时空分辨的蛋白质相互作用的动态变化精准解析。解析。解析。
技术研发人员：张丽华 安雨馨 赵群 杨开广 戴忠鹏 张玉奎
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：2020.11.30
技术公布日：2022/6/4