一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条及其检测方法

1.本发明涉及细菌检测技术领域，尤其涉及一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条。


背景技术：

2.鲍氏志贺氏菌是一种革兰氏阴性短小杆菌，是人类和灵长类动物的肠道致病菌。鲍氏志贺氏菌主要通过粪
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口途径传播，感染后引发腹痛、腹泻，严重时可能导致神经衰弱等症状。该食源性致病菌主要存在于沙拉(虾、土豆、鸡)、生蔬菜、奶类、水果和面包制品中。在食物的生产、加工和运输中，由于交叉感染，易导致鲍氏志贺氏菌感染事件的大规模爆发。
3.目前，鲍氏志贺氏菌检测主要依赖于国标规定的传统培养法及生化鉴定，其被视为鲍氏志贺氏菌检测的金标准。但是，该方法检测耗时，操作繁琐，不适合大批量样品检测。实验室常用的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)进行鲍氏志贺菌的检测，其灵敏度高，但需依靠专业的设备和操作人员，耗时长。免疫学检测由于检测周期短、操作方便、灵敏度较高，成为近年来发展迅速的检测手段。但是，我国目前尚未有可用于鲍氏志贺氏菌检测的快速检测产品。该专利以鲍氏志贺氏菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及鲍氏志贺氏菌的快速检测产品。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提出一种对鲍氏志贺氏菌实现有效检测，并且灵敏度高，用料节约，经济性优的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条及其检测方法。
5.为达到上述目的，本发明提出一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，所述试纸条自一端至另一端依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
6.所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；所述检测线靠近所述金标垫一端设置，所述质控线靠近所述吸水垫一端设置；
7.所述金标垫上设有与胶体金偶连的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为d8的杂交瘤细胞株分泌产生；所述检测线由保藏号为e8的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体构成；所述质控线由羊抗鼠抗体构成。
8.进一步的，还包括一块背衬，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均承载于所述背衬上。
9.根据权利要求1所述的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，在与胶体金偶连的单克隆抗体中，所述胶体金的粒径为30～40nm，所述胶体金与单抗的质量体积比为3μg/ml。
10.进一步的，所述胶体金的最适ph确定如下：
11.取多组胶体金溶液，每组溶液中加入不同量的0.2mol/l碳酸钾调整溶液调节所述胶体金溶液的ph，并且加入d8单克隆抗体进行反应，随后加入10μl10％nacl溶液持续反应，
进行离心操作，离心后观察到胶体金颜色最红，无聚沉、无褪色或变色现象的该组胶体金溶液为胶体金的最适ph。
12.进一步的，d8单克隆抗体与胶体金偶联的最佳结合量为：
13.取多组最适ph的胶体金溶液，每一组加入不同量的d8单克隆抗体，反应后，每一组均加入10μl 10％nacl溶液，取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/ml，为保证胶体金完全与抗体结合，以x+x
×
2为最佳结合量。
14.进一步的，与胶体金偶连的单克隆抗体制备如下：胶体金ph调节至最佳ph值，按d8单克隆抗体与胶体金偶联的最佳结合量吸取抗体以40μl/min滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后于4℃环境中持续搅拌1h，加入所述胶体金溶液1/10体积的含10％bsa的pb溶液，搅拌1h，移入离心管1000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用原胶体金溶液1/10体积的重悬液重悬，混合均匀后4℃保存备用。
15.本发明还提出一种鲍氏志贺氏菌的检测方法，样品滴在样品垫上，顺着金标垫、硝化纤维素膜和吸水纸的方向层析；
16.若样品中含有目标细菌，目标细菌与金标垫上的胶体金偶联的单克隆抗体结合，形成胶体金偶联抗体—细菌复合物，所述复合物流经检测线时，被检测线的单克隆抗体所捕获，形成胶体金偶联单克隆抗体—细菌—捕获抗体的三元复合物，使检测线出现可视化的颜色；随着继续层析，复合物被质控线上的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色；
17.若样品不含目标细菌，当样品流经金标垫时，胶体金偶联的单克隆抗体随样品层析，最终到达质控线，被质控线的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色。
18.与现有技术相比，本发明的优势之处在于：本发明采用了能相互配对的单克隆抗体分别设置于检测线和金标垫，结果表明能够检测鲍氏志贺氏菌，且检测灵敏度较高。
19.本发明通过对胶体金偶连的单克隆抗体的最适ph，d8单克隆抗体与胶体金偶联的最佳结合量进行探索，从而使用最少的原料实现对目标细菌的检测，实现检测最经济的目的。
附图说明
20.图1为本发明实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条的胶体金的紫外吸收光谱图；
21.图2为本发明实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条的结构示意图；
22.图3是发明实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条检测鲍氏志贺氏菌的灵敏度结果。
23.图4是发明实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条检测其他30株食源性致病菌(非鲍氏志贺氏菌)的交叉反应结果。
24.图5a是发明实例中模拟鲍氏志贺氏菌感染白菜样品后免疫胶体金试纸条检测结果。
25.图5b是发明实例中模拟鲍氏志贺氏菌感染面包样品后免疫胶体金试纸条检测结果。
26.图5c是发明实例中模拟鲍氏志贺氏菌感染牛奶样品后免疫胶体金试纸条检测结
果。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案作进一步地说明。
28.首先介绍本发明实施例中所使用的菌株、试剂与仪器：
29.使用的鲍氏志贺氏菌菌株编号为cmcc51346。
30.使用的其它食源性致病菌(非鲍氏志贺氏菌)菌株如表1所示。
31.表1本发明所用其它食源性致病菌
[0032][0033][0034]
主要试剂：
[0035]
bsa、peg、tween
‑
20来自sigma；氯金酸来自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(nc膜)135s millipore；羊抗鼠、hrp
‑
羊抗鼠生工生物工程股份有限公司。
[0036]
主要仪器：
[0037]
酶标仪spectramax m2购自molecular devices；nanodrop 2000c购自thermo scientific；点样仪ad6010购自bio
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dot；扫描仪phantom v9购自microtek；恒温培养摇床sph
‑
100b购自上海世平；单人净化工作台sw
‑
sj
‑
2d型购自苏州净化。
[0038]
实施例1鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条的制备
[0039]
步骤1：胶体金的制备过程
[0040]
1)1％氯金酸的配制：取1g氯金酸粉末，加入100ml灭过菌的双蒸水，配成1％氯金酸溶液，放4℃备用。
[0041]
2)1％柠檬酸三钠配制：取0.5679g二合水柠檬酸三钠，溶解到50ml双蒸水中，配成1％柠檬酸三钠溶液，现配现用。
[0042]
3)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，198ml双蒸水的烧瓶中，调节磁力搅拌器温度到120℃，搅拌速率为650rpm，加热至沸腾(约100℃)，立即加入1％氯金酸2ml，沸腾15s，充分搅拌同时迅速加入5.4ml 1％的柠檬酸三钠，计时10min，停止加热，冷却至室温，分装后4℃避光保存。
[0043]
步骤2：胶体金试纸条抗体最优ph的确定
[0044]
分别取100μl胶体金溶液于96孔板8个孔中，加入0.2mol/l碳酸钾调整溶液ph，加入量分别为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μl，每孔加入15μl浓度为0.86mg/ml的d8单克隆抗体。反应5min，各孔加入10μl 10％nacl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，从各孔中取50μl于1.5ml离心管中，10000rpm/min离心10min，观察复溶情况，重复三次。
[0045]
从左到右的8个孔中碳酸钾依次为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μl。当碳酸钾为0.6μl/100μl胶体金时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即此添加量是单抗d8偶联胶体金的最佳ph。
[0046]
步骤3：胶体金偶联抗体的最佳结合量的确定
[0047]
调节胶体金溶液ph至上述中得到的各抗体偶联的最佳ph值，各取100μl于96孔板中，按表2加入各抗体，反应5min，各孔加入10μl 10％nacl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/ml，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x
×
20％为最佳结合量。
[0048]
表3抗体与胶体金偶联最佳结合量
[0049][0050]
从左到右抗体质量/金溶液体积(μg/ml)分别为0，3，6，12，24，36，48，96μg/ml，当胶体金偶联抗体的浓度≥3μg/ml时，各孔中交替经颜色保持不变，即胶体金偶联抗体d8的最小结合量为3μg/ml。
[0051]
步骤4：抗体的胶体金标记
[0052]
胶体金ph调节至最佳ph值，按步骤2中确定的最佳结合量吸取抗体以40μl/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后于4℃环境中持续搅拌1h，加入胶体金溶液1/10体积的含10％bsa的pb溶液，搅拌1h，移入离心管1000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用原胶体金溶液1/10体积的重悬液重悬，混合均匀后4℃保存备用。如需保存较长时间，可加入0.3％叠氮化钠。
[0053]
步骤5：鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条的组装及结构示意图。
[0054]
图2是本发明鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条10的结构示意图。
[0055]
试纸条自一端至另一端依次设有样品垫14、金标垫13、硝酸纤维素膜12和吸水垫11；
[0056]
硝酸纤维素膜12上设有质控线16和检测线15；检测线15靠近金标垫13一端设置，质控线16靠近吸水垫11一端设置；
[0057]
金标垫13上设有与胶体金偶连的单克隆抗体，单克隆抗体由保藏号为d8的杂交瘤细胞株分泌产生；检测线由保藏号为e8的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体构成；质控线16由羊抗鼠抗体构成。
[0058]
将步骤4中制备好的金标抗体喷涂于检测试纸条的金标垫上，记d8
‑
au
‑
pad，将浓度为0.86mg/ml的抗体d8包被于硝酸纤维素膜12上作为test line，即检测线，也称t线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠抗体作为金标单抗试纸条的control line，即质控线线，也称c线。然后，组装试纸条。
[0059]
鲍氏志贺氏菌的检测方法如下，样品滴在样品垫上，顺着金标垫、硝化纤维素膜和吸水纸的方向层析；
[0060]
若样品中含有目标细菌，目标细菌与金标垫上的胶体金偶联的单克隆抗体结合，形成胶体金偶联抗体—细菌复合物，所述复合物流经检测线时，被检测线的单克隆抗体所捕获，形成胶体金偶联单克隆抗体—细菌—捕获抗体的三元复合物，使检测线出现可视化的颜色；随着继续层析，复合物被质控线上的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色；
[0061]
若样品不含目标细菌，当样品流经金标垫时，胶体金偶联的单克隆抗体随样品层析，最终到达质控线，被质控线的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色，检测线不显示颜色
[0062]
步骤6：鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条灵敏度实验。
[0063]
将培养好的鲍氏志贺氏菌菌液用营养肉汤培养基依次稀释至108、107、106、105、104c fu/ml，不同浓度菌液均以100μl滴加至试纸条的样品垫上，进行检测，并重复三次。
[0064]
挑取鲍氏志贺氏菌单菌落于培养基中，置于37℃摇床培养12h，平板菌落计数算得纯菌液浓度为1.3
×
108cfu/ml，由图3可知，滴加浓度为108、107、106、105、104cfu/ml菌液后，试纸条t线显色，滴加104cfu/ml菌液t线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达105cfu/ml，三次重复结果均为105cfu/ml，灵敏度稳定性较好。
[0065]
步骤7.：鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条交叉反应实验。
[0066]
用制备好的试纸条检测30株培养至108cfu/ml的其它食源性致病菌(非鲍氏志贺氏菌)并观察结果。
[0067]
图4是本发明实例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测30株其它食源性致病菌(非鲍氏志贺氏菌)的交叉反应结果。
[0068]
由图4可知，100μl浓度为108cfu/ml的30株其他食源性致病菌(非鲍氏志贺氏菌)的菌液滴加到样品垫后，t线均未显色。结果表明，该试纸条与其他食源性致病菌无交叉反应。
[0069]
步骤8.鲍氏志贺氏菌胶体金试纸条模拟带菌实验。
[0070]
鲍氏志贺氏菌经营养肉汤过夜培养，菌落平板计数确定菌液浓度。取25g白菜样品加入到含有225ml营养肉汤的锥形瓶中，121℃灭菌30min，在无菌操作台中加入稀释的鲍氏志贺氏菌菌液(鲍氏志贺氏菌cmcc51346)，保证鲍氏志贺氏菌的浓度为1cfu/ml。置于37℃的摇床中培养，设置摇床的转速为200r/min。每1小时取一次样品，用试纸条进行检测，连续检测14个小时。牛奶和面包样品的模拟带菌实验同上述方法
[0071]
图5为本发明的模拟带菌实验的结果。其中a
‑
c分别为白菜、面包和牛奶的模拟带菌实验结果。
[0072]
由图5可知，该试纸条在白菜、牛奶和面包中分别孵育8h、9h和10h时可检测出阳性结果，检测限低至1cfu/ml。
[0073]
本发明根据杂交瘤细胞株d8和e8生产出相应的单克隆抗体，即d8作为金标抗体，e8作为检测抗体，制成免疫胶体金试纸条。实验表明此试纸条对特异性高，灵敏度较高且无交叉反应。
[0074]
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。