用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物巧片技术领域，尤其设及一种用于检测食品中氨基糖巧类抗生素 残留的抗体巧片试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 氨基糖巧类抗生素抗菌谱广，尤其是对革兰氏阴性菌有强大杀灭作用，在兽医临 床上常用于治疗细菌感染，细菌性肠炎和乳腺炎。在畜牧养殖中，也被添加到饲料中用于预 防和促生长。不合理用药导致药物在动物可食性组织中蓄积，人食用之后，出现前庭功能障 碍和耳蜗听神经损伤、肾功能降低、甚至呼吸停止，直接危害人类的健康。因此我国对氨基 糖巧类抗生素规定了最高残留限量（MRL)，规定新霉素在牛奶和猪肌肉中M化为500 y g/ kg，庆大霉素在牛奶的MRL为200 y g/kg，猪肌肉的MRL为100 y g/kg。
[0003] 目前，氨基糖巧类抗生素的检测方法主要有微生物法、胶体金试纸条、仪器分析法 W及Elisa。微生物法和胶体金试纸条准确度和特异性较差，只能作为筛选方法。仪器分析 法依赖昂贵的设备，需要专业人员操作，不便于推广。Elisa具有灵敏度高、特异性好、操作 简便等优势，是目前最广泛应用的检测方法，但仅能检测单一组分，通量有待提高。近年来 发展迅速的抗体巧片检测技术既具有Elisa的优势，又具备巧片技术高通量、低成本、高平 行、微型化和极高的灵敏度等特点，非常适合用于大量样本中多种药物的同时检测。
[0004] CN 102585006A公开了一种用于检测新霉素、阿米卡星和己龙霉素的单抗和酶联 免疫方法与试剂盒；CN 102608319A公开了一种用于检测庆大霉素和西索霉素的单克隆抗 体及酶联免疫方法与试剂盒，W上两个发明不能同时检测W上五种氨基糖巧类抗生素，而 且检测灵敏度较低，前者对新霉素在猪肌肉中的最低检测限（LOD)为15. 90yg/l，后者对 庆大霉素在鸡肌肉中的最低检测限（LOD)为34.09 yg/L。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种用于检测食品中氨基糖巧类抗生素残留的抗体 巧片试剂盒。
[0006] 该试剂盒包括巧片、抗体、切3标记的二抗、提取试剂，所述抗体由新霉素单克隆抗 体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO: C201144的 杂交瘤细胞邸C/5G04所分泌的，能识别新霉素、阿米卡星W及己龙霉素；所述庆大霉毒单 克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201145的杂交瘤细胞邸C/2D5所分泌的，能识别庆大霉 素和西索霉，所述巧片固定了阿米卡星包被原和西索霉素包被原，所述阿米卡星包被原是 阿米卡星与卵清蛋白的偶联物，所述西索霉素包被原是西索霉素与卵清蛋白的偶联物。
[0007] 所述的保藏号为CCTCC N0:C201144的杂交瘤细胞邸C/5G04已在本申请人于2012 年2月27日申请的"用于检测新霉素、阿米卡星和己龙霉素的单抗和酶联免疫方法与试剂 盒"的发明专利中公开，公开号为102585006A，公开日为2012年7月18日。
[000引 所述的保藏号为CCTCC N0:C201145的杂交瘤细胞邸C/2D5已在本申请人于2012 年2月27日申请的"用于检测庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂 盒"的发明专利中公开，公开号为102608319A，公开日为2012年7月25日。
[0009] 优选地，所述的巧片按如下方法制备；W晶巧高分子基片G作为基片，用围栏将基 片分成两排共12个反应区域，每个反应区域设四排=纵共12个微阵列，将阿米卡星包被原 溶液、西索霉素包被原溶液，W及两种对照溶液一一卵清白蛋白溶液和切3标记的卵清白蛋 白溶液分别点样在其中一排微阵列上，点样完成后固定0.化，用2% (重量百分比）牛血清 白蛋白溶液封闭0.化。
[0010] 优选地，所述阿米卡星包被原溶液的浓度为6 y g/mU所述西索霉素包被原溶液的 浓度为32 y g/mU所述阿米卡星包被原溶液和西索霉素包被原溶液的溶剂是含5% (重量 百分比）甘油的抑值为9. 16的碳酸盐缓冲液。
[0011] 优选地，所述微阵列上的点样顺序是从上到下，从左至右。
[0012] 优选地，所述的切3标记的二抗是切3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
[0013] 优选地，所述的提取试剂是按如下方法配制的；准确吸取S氯己酸311心超纯水稀 释，定容至100血；
[0014] 本发明的第二个目的是提供所述的抗体巧片试剂盒在检测食品中氨基糖巧类抗 生素残留的应用。
[0015] 本发明的第S个目的是提供一种用于检测食品中氨基糖巧类抗生素残留的抗体 巧片方法，该方法包括W下步骤：
[0016] 1)样品前处理；样品匀浆后加入提取试剂提取；
[0017] 2)将样品液和稀释好的抗体按1 : 1的体积比混合后加入到固定了阿米卡星包被 原溶液、西索霉素包被原溶液、W及对照溶液一一卵清白蛋白溶液和切3标记的卵清白蛋白 溶液的巧片上，于37°C反应0.化，洗漆3次，甩干；
[001引 3)将切3标记的二抗加到巧片，于37°C反应0.化，洗漆3次，甩干；
[0019] 4)用InnoScan 700A扫描仪对巧片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和切3标记的卵 清白蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析。
[0020] 所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗 体是由保藏号为CCTCC N0:C201144的杂交瘤细胞邸C/5G04所分泌的，能识别新霉素、阿米 卡星W及己龙霉素；所述庆大霉毒单克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201145的杂交瘤 细胞邸C/2D5所分泌的，能识别庆大霉素和西索霉；
[0021] 所述阿米卡星包被原是阿米卡星与卵清蛋白的偶联物，所述西索霉素包被原是西 索霉素与卵清蛋白的偶联物；
[0022] 所述的切3标记的二抗是切3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
[0023] 优选地，所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取S氯己酸311心超纯水稀 释，定容至100血。
[0024] 优选地，所述抗体是用抑7. 4的磯酸盐缓冲液稀释的，其中新霉素单克隆抗体的 稀释度为1:800,庆大霉毒单克隆抗体的稀释度为1:4000 ;所述阿米卡星包被原溶液的浓 度为16 y g/mU所述庆大霉毒包被原溶液的浓度为20 y g/mU所述阿米卡星包被原溶液和 庆大霉毒包被原溶液的溶剂是含有5%甘油的pH9. 16的碳酸盐缓冲液。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 1)本发明的抗体巧片试剂盒可W同时检测5种氨基糖巧类抗生素--新霉素、阿 米卡星、己龙霉素、庆大霉素和西索霉，为食品中的氨基糖巧抗生素残留检测提供了一个快 速、灵敏、高通量的方法，而现有的试剂盒无法同时检测W上药物。
[0027] 2)本发明所建立的抗体巧片试剂盒和检测方法准确度高，精密度好、检测效率高。 新霉素的ICs。为1C 5。为1. 87 y g/L，庆大霉素的1C 5。为10. 40 y g/l，对新霉素在猪肌肉中的 最低检测限（LOD)为7. 43 y g/l，对庆大霉素在猪肌肉中的最低检测限（LOD)为10. 96 y g/ L。
[002引 3)与现有的方法相比，不仅在检测药物的种类上具有明显的优势，而且可W节省 大量的时间和成本，具有更好的市场应用价值。方法中所设及的样品前处理方法简单，快 速，所使用的有机溶剂为甲醇，对人体及环境危害较小。再者，本发明采用示踪物质是巧光 物质，信号持续时间长。
【附图说明】
[0029] 附图1是本发明的技术路线图。
[0030] 附图2是基片优化的结果，图中1是不同基片相对巧光信号强度的比较，2是不同 基片背景值的比较。
[0031] 附图3是4种点样顺序W及点样顺序的优化结果，图中B、C、D、E是4种点样顺序， A是点样效果示意图，C是最优的点样顺序图。
[0032] 附图4是点样溶液和封闭液的优化结果，图中1是不同缓冲溶液作为点样液的优 化结果，2是不同pH的CBS作为点样液的优化结果，3是添加不同表面活性的固定效果的比 较，4是封闭液的优化结果。
[0033] 附图5是抗体稀释液和反应温度的优化结果，图中1是一抗稀释液的优化结果，2 是二抗稀释液的优化结果，3是反应温的优化结果。
[0034] 附图6是制备抗体巧片过程中各时间的优化结果，图中1是固定时间的优化结果， 2是封闭时间的优化结果，3是一抗反应时间的优化结果，4是二抗反应时间的优化结果。 [003引附图7是本发明采用的固相载体W及分区示意图