-20 y g/l，但相关系数都达不到0. 99,所 W调整标准曲线范围为0. 625-10 y g/L。
[0061] 同理优化了西索霉素包被原和庆大霉素单克隆抗体浓度，结果得到最佳西索霉素 包被原溶液的浓度为20 y g/mU最佳庆大霉素单克隆抗体的稀释度为1:4000。
[0062] 3)点制氨基糖巧类抗体巧片
[006引将载体用围栏分成12(2X6)个反应区域如附图7所示。分别用AD3200点样仪把 1 % OVA溶液、16 y g/mL阿米卡星包被原溶液、20 y g/mL西索霉素包被原溶液、切3-OVA溶 液在每个区域进行点样，2化L/点，每个区域形成1个3X4的点阵。将点样后的巧片置于密 闭的湿盒中，置于37°C恒温箱中固定0.化。将巧片放入含PBST (量W淹没玻片为准）洗漆 管中，用摇床振摇/手动摇洗2min，重复S次，再放入含d地20 ( W淹没玻片为准）洗漆管中 用摇床振摇/手动摇洗2min，重复S次，最后将玻片W 2000r/min转速4°C离屯、Imin。然 后加入20 y L/孔2% BSA封闭液，放入密闭的湿盒中，置于37°C恒温箱封闭0.化，洗漆后， 37°C烘干5min，抽真空封装存于4°C备用。
[0064] 实施例4氨基糖巧类抗体巧片的性能考核
[0065] 1)标准曲线的建立
[0066] 配制氨基糖巧类混合抗体（1:800新霉素抗体和1:4000庆大霉素抗体），用PBS将 新霉素和庆大霉素标准品配制成6个浓度的混合标准溶液化625-10 y g/L新霉素标准溶 液，2. 5-40 y g/L庆大霉素标准溶液）。分别将10 y L混合药物和10 y L混合抗体加到巧片 上，反应0.5小时，使固定的人工抗原充分与样品中的药物共同竞争特异性抗体，洗漆，离 屯、甩干。加入20 uL 1:200稀释的切3标记羊抗小鼠IgG，反应0.5小时。洗漆，离屯、甩干。 将甩干的巧片使用InnoScan700A扫描仪进行扫描，用Mapix分析软件进行分析。W竞争物 浓度的对数值为横坐标、对应的抑制率F/F。为纵坐标，绘制标准曲线，见附图8得到回归方 程及相关系数，根据回归方程计算ICg。。得到新霉素的ICg。为1C W为1. 87 y g/l，线性范围 为0.625-10 ^径/1，庆大霉素的1〔5。为10.40^径/1，线性范围为2.5-40^径/1。相同方法， 重复测定5批，求出ICg。平均值，并计算片内与片间变异系数，得到片内片间变异系数均小 于15%，说明重复性良好。
[0067] 2)灵敏度
[0068] 测定20份0 y g/L竞争物标准溶液，将F值分别代入标准曲线回归方程计算对应 浓度值，求20份测定浓度值的平均值（文）和标准差（SD)。根据公式z=无+3XSD计算Z 值，作为抗体巧片检测方法灵敏度的判定指标。得到氨基糖巧类抗体巧片检测方法新霉素 的灵敏度为0. 55 yg/l，庆大霉素的灵敏度为5. 22 yg/l，远远低于各自的最大残留限量。
[0069] 如特异性
[0070] 分别将氨基糖巧类及其结构类似物标准品倍比稀释成一系列浓度绘制标准曲线， 计算ICw值，与标准品1C W值对比得到交叉反应率。结果见表1，该抗体巧片能够很好地识 别新霉素、阿米卡星，己龙霉素W及庆大霉素，对西索霉素也有一定识别。
[0071] 表1氨基糖巧类抗体巧片的交叉反应率结果
[0072]
【主权项】
1. 一种用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，包括芯片、抗体、 Cy3标记的二抗、提取试剂，其特征在于：所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单 克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201144的杂交瘤细胞 EDC/5G04所分泌的，能识别新霉素、阿米卡星以及巴龙霉素；所述庆大霉毒单克隆抗体是 由保藏号为CCTCC N0:C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的，能识别庆大霉素和西索霉 素，所述芯片固定了阿米卡星包被原和西索霉素包被原，所述阿米卡星包被原是阿米卡星 与卵清蛋白偶联物，所述西索霉素包被原是西索霉素与卵清蛋白偶联物。
2. 如权利要求1所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒， 其特征在于所述的芯片按如下方法制备：以晶芯高分子基片G作为基片，用围栏将基片分 成两排共12个反应区域，每个反应区域设四排三纵共12个微阵列，将阿米卡星包被原溶 液、西索霉素包被原溶液，以及两种对照溶液--卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白 溶液分别点样在其中一排微阵列上，点样完成后固定〇.5h，用2%牛血清白蛋白溶液封闭 0. 5h〇
3. 如权利要求2所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒， 其特征在于：所述阿米卡星包被原溶液的浓度为16 μ g/mL，所述西索霉素包被原溶液的浓 度为20 μ g/mL，所述阿米卡星包被原溶液和西索霉素包被原溶液的溶剂是含有5 %甘油的 pH9. 16碳酸盐缓冲液。
4. 如权利要求1所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其 特征在于：所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
5. 如权利要求1所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其 特征在于所述的提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取三氯乙酸3mL，超纯水稀释，定容 至 10OmT, η
6. 权利要求1-5任何一项所述的抗体芯片试剂盒在检测食品中氨基糖苷类抗生素残 留的应用。
7. -种检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 样品前处理：样品匀浆后加入提取试剂提取； 2) 将样品液和稀释好的抗体按I : 1的体积比混合后加入到固定了阿米卡星包被原溶 液、西索霉素包被原溶液、以及对照溶液--卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液 的芯片上，于37°C反应0. 5h，洗涤3次，甩干； 3) 将Cy3标记的二抗加到芯片，于37°C反应0. 5h，洗涤3次，甩干； 4) 用InnoScan 700A扫描仪对芯片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白 蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析， 所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是 由保藏号为CCTCC N0:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的，能识别新霉素、阿米卡星 以及巴龙霉素；所述庆大霉毒单克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201145的杂交瘤细胞 EDC/2D5所分泌的，能识别庆大霉素和西索霉； 所述阿米卡星包被原是阿米卡星与卵清蛋白的偶联物，所述西索霉素包被原是西索霉 素与卵清蛋白的偶联物； 所述Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
8. 如权利要求7所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，其特 征在于：所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取三氯乙酸3mL，超纯水稀释，定容至 IOOmL0
9. 如权利要求7所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，其 特征在于：所述抗体是用PH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释的，其中新霉素单克隆抗体的稀释度 为1:800,庆大霉毒单克隆抗体的稀释度为1:4000 ;所述阿米卡星包被原溶液的浓度为 16 μ g/mL，所述西索霉素包被原溶液的浓度为20 μ g/mL，所述阿米卡星包被原溶液和西索 霉素包被原溶液的溶剂是含有5%甘油的pH9. 16的碳酸盐缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一种检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是由保藏号为CCTCC？NO:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的；所述庆大霉毒单克隆抗体是由保藏号为CCTCC？NO:C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的，所述芯片固定了阿米卡星包被原和西索霉素包被原。本发明还公开了一种用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，该方法可以同时检测5种氨基糖苷类抗生素，从而为食品中的氨基糖苷类抗生素残留检测提供了一个快速、灵敏、高通量的方法，具有准确度高，精密度好、效率高等特点。
【IPC分类】G01N33-02, G01N33-577
【公开号】CN104569325
【申请号】CN201410829545
【发明人】袁宗辉, 彭大鹏, 魏娜娜, 王玉莲, 陈冬梅, 陶燕飞, 刘振利
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月26日