一种一步薄层层析快速检测生物胺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种一步薄层层析快速检测生物胺的方法，属于食品分析和安全技术 领域。
【背景技术】
[0002] 生物胺是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称；含有蛋白质和氨 基酸的食品，在一定条件下通过氨基酸的脱羧反应或醛的胺化作用便可产生生物胺。目前 已发现水产品、肉制品、干酪及乳制品、酒及各类发酵食品、蔬菜、水果、干果和巧克力等食 品中均含有多种生物胺。过量的生物胺被证明对人体会产生一些不良的生理反应，在食品 保藏学中，生物胺往往是在食品腐烂或发酵过程中产生；组胺和酪胺是存在于食品中含量 最多、也是对人类健康影响最大的两种生物胺。
[0003] 欧洲食品安全局（EFSA)将欧盟范围内含大量组氨酸鱼制品中组胺的含量制定为 < 100mg/kg或100?200mg/kg ;将用含大量组氨酸鱼类制作、在盐水中经酶熟化处理的制 品组胺含量制定为< 200mg/kg或200?400mg/kg。EFSA对食品中的组胺含量没有加以 限定，建议上限为l〇〇mg/kg(食品）或2mg/L(含酒精饮料）；美国食品药品管理局（FDA) 基于组胺500mg/kg的毒性，制定美国国内金枪鱼、鬼头刀及相关鱼类中组胺的干预水平为 50mg/kg。同时认为，500?1000mg/kg以上的组胺对人体健康有潜在危险。而对酪胺和苯乙 胺的安全阈值，所给出的建议参考上限分别为100?800mg/kg和30mg/kg ;我国GB2733- 2005《鲜（冻）动物性水产品卫生标准》规定鲐鱼中组胺含量应低于1000mg/kg，其他鱼类 中组胺含量应低于300mg/kg。
[0004] 目前食品中生物胺的检测一般采用高效液相色谱（HPLC)，生物传感器等方法。这 些方法均有一定的应用，也各有优缺点；如最常用的RP - HPLC法，一般认为其具有检测灵 敏度高、定量分析准确和柱效高等优点，且有多个标准方法基于该技术实施；但是该方法需 要高效液相色谱，且仪器预热平衡和分析等过程时间较长，速度较慢，灵活性较差。生物传 感器由于其具有在线监测的能力被推崇，但是现有技术仍不是非常成熟，市场较少有可靠 的成套装备，且价格较昂贵。
[0005] 薄层色谱是一种无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷，检测限能够达到 ng级别的方法。现已有效地应用于临床和生化检验、毒物分析、药材及其制剂真伪的鉴定、 质量控制、含量测定和资源调查等方面。但是薄层色谱需先对样品进行衍生再进行薄层层 析检测，其中对样品的衍生化处理最为关键，一般需要考虑到衍生剂的选择、衍生剂与样品 液的体积比、衍生反应的时间和温度。
[0006] 因此在食品加工和流通等环节迫切需要一种无需对样品进行衍生处理，将样品点 在薄层层析板就能够检测的一步薄层层析检测生物胺的方法，从而满足现场快速检测的需 要，切实保障食品安全。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服上述现有技术中的缺点，提供一种一步薄层层析快速检测生 物胺的方法，本发明设计巧妙、易操作、成本低、速度快、适于大规模应用。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种快速检测生物胺的方法，所述方法包括：（1)活 化硅胶的制备：对硅胶进行环氧基、氨基、醛基的活化，使硅胶依次接上环氧基、氨基和醛 基；⑵活化薄层层析板的制备：活化好的硅胶介质分别进行调衆，铺板和层析板活化制得 活化薄层层析板；（3)待测样品中生物胺的薄层层析分析：从待测样品中进行生物胺提取、 生物胺提取液净化得到的生物胺净化液，点在活化的薄层层析板上，展开，检测目标生物胺 的有无或者定量测定生物胺的含量。
[0009] 所述步骤（1)，在本发明的一种实施方式中，是使用环氧氯丙烷、双环氧乙烷、苯氧 基环氧丙烷、二一（环氧丙基）一邻苯并咪唑酮中的任意一种对硅胶进行环氧基活化。 [0010] 所述环氧基活化，在本发明的一种实施方式中，环氧基的活化条件：以体积比 1:0. 5-1:2的0. 4-1. 2mol/LNaOH溶液与DMSO的混合液作为混合溶剂，震荡，活化温度为 30-40°C，活化时间8-14h，环氧氯丙烷、双环氧乙烷、苯氧基环氧丙烷或二一（环氧丙基）一 邻苯并咪唑酮的用量为2-10mL/g硅胶。
[0011] 所述环氧基活化，在本发明的一种实施方式中，以环氧氯丙烷作为环氧基活化 液，NaOH溶液浓度为0. 8-1. Omol/L，NaOH溶液与DMSO体积比为1:1-1:1. 5,活化温度为 33-36°C，活化时间为10_12h，环氧氯丙烷的用量为4-7mL/g硅胶。
[0012] 所述步骤（1)，在本发明的一种实施方式中，是使用氨水、氯胺、乙二胺、双氯胺中 的任意一种对硅胶进行氨基活化。
[0013] 所述氨基活化，在本发明的一种实施方式中，氨基的活化条件：以质量分数为 5% -15%的氨水、氯胺、乙二胺或双氯胺作为活化液系，震荡，活化温度为32-38 °C，活化时 间8-14h，5% -15%的氨水、氯胺、乙二胺或双氯胺的用量为15-30ml/g硅胶。
[0014] 所述氨基活化，在本发明的一种实施方式中，以氨水作为氨基活化液，氨水浓度为 8% -12%，活化温度为34-36°C，活化时间为10_12h，8% -12%的氨水的用量为18-24ml/g 硅胶。
[0015] 所述步骤（1)，在本发明的一种实施方式中，是使用邻苯二甲醛、戊二醛、乙二醛、 己二醛中的任意一种对硅胶进行醛基活化。
[0016] 所述醛基活化，在本发明的一种实施方式中，醛基的活化条件：以6_12g/L的邻 苯二甲醛、戊二醛、乙二醛或己二醛作为活化液系，震荡，活化温度为26-32°C，活化时间 15-45min，6-12g/L的邻苯二甲醛、戊二醛、乙二醛或己二醛的用量为5-12ml/g硅胶。
[0017] 所述醛基活化，在本发明的一种实施方式中，以邻苯二甲醛作为醛基活化液，邻苯 二甲醛浓度为8-10g/L，活化温度为30°C，活化时间为30min，8-10g/L邻苯二甲醛的用量为 6_8ml/g 娃胶。
[0018] 所述硅胶，在本发明的一种实施方式中，是采用100-200目国产硅胶或采用 200-300目德国默克公司进口硅胶。
[0019] 所述步骤（2)中的调浆，在本发明的一种实施方式中，是每取活化硅胶6_14g，加 入2. 2-2. 8g无水硫酸钙，加入6-12ml去离子水，使固液1:0. 5-1:1. 5混合调成匀浆；
[0020] 所述调浆，在本发明的一种实施方式中，是称取活化硅胶量为的10-12g，加入的无 水硫酸钙为2. 4-2. 6g，加入的去离子水为8-10mL，固液比为1:0. 8-1:1. 2。
[0021] 所述步骤（2)中的铺板，在本发明的一种实施方式中，是将匀浆均匀倾倒在层析 板上，然后真空干燥。
[0022] 所述铺板，在本发明的一种实施方式中，基本步骤：将匀浆均匀倾倒在层析板上， 采用倾注法或用薄层涂铺器手工铺板，将铺好的板放入真空干燥器中，真空干燥l_2h，表面 水分完全蒸发后用小刀和直尺将边缘部分刮去。
[0023] 所述铺板，在本发明的一种实施方式中，层析板为玻璃层析板、氧化铝层析板或塑 料板，涂板方法采用薄层涂铺器进行手工铺板，真空干燥时间为I. 4-1. 6h。
[0024] 所述步骤（2)中的层析板活化，在本发明的一种实施方式中，是将铺板后的薄层 层析板放入充满保护气体的装置中进行层析板活化，活化后迅速放入装有变性硅胶干燥剂 的装置中备用。使用保护气体能够保护薄层层析板上的醛基不被氧气氧化，从而能够与生 物胺的氨基发生席夫碱反应而结合。变色硅胶的目的是为了吸去薄层层析板中的水分。
[0025] 所述保护气体可以是以下任意一种：氮气、氦气、氙气、氩气、氪气。
[0026] 在本发明的一种实施方式中，活化硅胶的干燥及薄层层析板的活化在保护气体的 保护下完成，可以有效防止硅胶上连接的醛基被氧化，保证薄层层析板的功效。
[0027] 所述层析板活化，在本发明的一种实施方式中，基本步骤：将铺好的薄层层析板放 入充满保护气体的塑料盒，然后将塑料盒放入l〇5°C烘箱活化30-45min，活化完成后迅速 放入装有变性硅胶干燥剂的塑料箱中备用；
[0028] 所述层析板活化，在本发明的一种实施方式中，活化时间为35_40min ;
[0029] 所述步骤（2)，在本发明的一种实施方式中，在调浆前需要对活化的硅胶进行干燥 处理。所述干燥处理，在本发明的一种实施方式中，是将活化硅胶置于充满氮气或氦气的塑 料盒然后于36-38?烘箱中干燥；调浆步骤中无水硫酸钙含量为12-15%。
[0030] 所述步骤（3)中的生物胺净化液，在本发明的一种实施方式中，按以下方法制备： 将食品样品，用水、酸性介质或有机相介质提取样品中生物胺，然后用三氯乙酸稀释，获得 生物胺提取液；将生物胺提取液与正己烷混合、萃取脱去脂肪，然后进行液一液萃取，氮气 吹干并加入盐酸溶解残留物，获得生物胺净化液。
[0031] 所述步骤（3)中生物胺的检测，在本发明的一种实施方式中，是：采用碘蒸汽或喷 雾显色或者不显色，然后于360nm紫外条件下对色谱板进行观察以确定样品中是否存在目 标生物胺，或者是采用薄层扫描仪在参比波长360nm，样品波长254nm条件下对色谱板进行 扫描，根据每个斑点的吸光值进行定量计算。
[0032] 所述薄层扫描仪，在本发明的一种实施方式中是岛津双波长飞点薄层扫描仪 CS-93